苹果酒香气成分代谢研究进展

杨颖迪,李 闽,彭帮柱

(华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070)

目前,我国已形成渤海湾产区、西北产区、中部产区三大苹果主产区域,并成为世界最大的苹果生产国,苹果产业已成为地域性经济支柱产业之一。浓缩果汁是我国苹果深加工的主打产品,由于国内浓缩汁深加工开发利用力度不够,绝大部分主要依靠出口,约占世界出口总量的60%。由于质量标准与控制体系不够完善,出口贸易壁垒等问题的存在致使单一产品的市场风险极大,这严重制约了我国苹果种植业和加工业的进一步发展,亟须走多元化发展之路。

苹果富含矿物质、维生素、多酚类等营养成分,对人体具有极好的功能保健作用。苹果酒是指由苹果或苹果汁生产的一种低酒精度的发酵果酒[1]。在全世界范围内,苹果酒已成为产量仅次于葡萄酒的第二大果酒,具有较高的保健价值,有助于改善人体血液的微循环,提高肝、肾及肺功能,起到预防疾病、增进健康的作用[2-4]。目前,在国家大力提倡“粮食酒向水果酒转变,高度酒向低度酒转变,蒸馏酒向发酵酒转变,普通酒向优质酒转变”的产业政策下,苹果酒迎来了很好的发展契机[5]。苹果酿酒是延伸苹果种植、加工产业链的良好途径,且苹果酒的发展和生产符合我国产业宏观调控政策,能创造可观的经济效益,带来广泛的社会效应,这必将发展为我国苹果深加工的又一主导产品。

1 苹果酒主要香气成分

苹果酒香气是影响苹果酒品质的主要因素,也是苹果酒质量评价的重要指标[6-7],主要是一些高级醇类、酯类、低级脂肪酸、缩醛、内酯和萜烯等微量成分,与苹果原料、酵母种类、发酵过程和陈酿过程等相关,主要包括原料香气、发酵香气和陈酿香气等。苹果酒香气成分复杂而含量微少,不同酿造阶段,香气成分种类和含量一直处于动态变化之中。其中,高级醇类主要包括:2,3-丁二醇、正己醇、2-辛醇、苯乙醇、异戊醇等[6,8];羧酸类化合物主要包括:己酸、辛酸、癸酸[5];酯类化合物主要为乙酯类化合物(含量最高、最重要),如乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等[9],乙酸酯类化合物,如乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯等[5,10];醛类和酮类;烯萜类化合物等[6,11-13]。

通过大量研究发现苹果酒的绝大部分香气物质在发酵过程中形成[14-19],酵母是形成苹果酒香气的第一因素,发酵条件是第二因素[6-7,20];就苹果本身的挥发性香气成分而言,绝大多数在发酵过程中被转化或者降解[6]。Williams等[14]用去除挥发性香气的sweet coppin苹果汁生产苹果酒,发现苹果固有的挥发性香气成分对苹果酒的香气影响很小。Morton等[15]用不同品种的苹果进行苹果酒发酵,发现除金冠等有典型风味的品种外,大部分品种苹果的挥发性成分在加工过程中损失。于爱梅等[17]认为不同品种苹果的香气物质对苹果酒的品质有重要影响。汪立平[18]通过对比前人研究成果发现,苹果的品种不同,对苹果酒成品香气成分的影响程度也不同。

2 苹果酒香气成分分析

酒类的香气成分分析方法有静态顶空气相色谱法)、动态顶空气相色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[18]。目前多采用GC-MS技术来进行香气成分的定性和定量分析,此技术检测灵敏度高,分离效果好,并且随着仪器的不断完善、成熟和推广,其应用越来越广泛[21]。苹果酒香气分析前,通常要对香气成分进行浓缩预处理,常见的浓缩预处理方法有:蒸馏法[22]、液液萃取法[23]、固相萃取法[24]、动态顶空技术法[25]、固相微萃取法(简称SPME)[26]、吸附法[27]、直接进样法[28]等。除固相微萃取外,其他方法都是传统的样品预处理方法,都不同程度地存在某些缺点:花费过高,样品量过大、耗时过长,使用的有机溶剂昂贵且有害,并可能在浓缩过程中损失香气物质[18]。固相微萃取作为二十世纪九十年代以来才出现的一种新的样品处理方法,它几乎改善了上述传统预处理方法的所有缺点,集采样、浓缩、萃取、进样于一体,能够尽可能地减少被分析的香气物质的损失,且能与GC、HPLC联用分析[18]。

近年来,近红外光谱分析技术凭借其快速、准确、无损、方便等特点迅猛发展,广泛应用于食品科学领域的研究[29]。由于近红外光谱适合进行实时在线检测,在酿造发酵行业也被广泛关注[30-32]。利用近红外光谱技术建立苹果酒发酵过程中特征香气的快速检测模型,然后以此模型作为分析工具,将其应用到苹果酒发酵过程特征香气生成动力学研究范畴,可以克服苹果酒发酵过程中传统监测方法费时、费力、反馈不及时等缺陷,可为苹果酒香气代谢控制研究提供可行的理论依据和技术支撑。已有学者采用近红外光谱技术对酒类挥发性物质进行分析目前的研究多集中在葡萄酒、啤酒和黄酒,在苹果酒中的应用尚处于研究阶段[5,33]。

感官评价法是评价苹果酒香气的主要方法之一[34]。嗅闻法和风味强度法都是基于感官评价的基础上对香气成分的重要性进行评定[18]。感官评价法较为灵活,用此法对苹果酒的风味进行评价可以较大程度上反映出大众的偏好;但该方法对于评酒人员的要求较高,而且会受到评酒人员的主观、环境等因素的影响,这在一定程度上限制了其结果的客观性[10]。

近年来,研究学者着眼于研究与分析苹果酒香气质量的客观评价方法和体系,利用主成分分析法来建立苹果酒香气质量的评价模型[35-36],对酒样香气组分进行客观的统计分析,丰富和完善苹果酒的质量评价体系。主成分分析是利用几个较少的综合指标反映原来指标的一种统计方法,将原来的指标重新组成一组新的互相无关的几个综合指标来代替原来指标,从而达到简化数据和揭示变量间关系的目的[37]。主成分分析方法与感官评价无直接关系,能避免传统的嗅闻法和风味强度法的不稳定性[18]。

3 主要香气物质的合成途径

3.1 高级醇类化合物

高级醇类物质的形成在发酵过程中通常有两种途径,一种是降解代谢途径(Ehrlich代谢机制),一种是合成代谢途径(Harris代谢机制)。这两种途径都是酿酒酵母在发酵过程中通过相应α-酮酸的脱羧作用而实现的[5,38]。1907年,德国化学家Ehrlich首先提出由氨基酸形成高级醇的途径,通过研究者在之后几十年的不断探索,此途径得到修改和完善:首先氨基酸经转氨酶的作用形成α-酮酸,其氨基被转移到α-酮戊二酸生成谷氨酸;然后酮酸经酮酸脱羧酶的作用形成少一个碳原子的醛;最后醛在醇脱氢酶的作用下形成醇[38-39]。Harris于1953年研究并提出了高级醇的合成代谢途径:葡萄糖经糖酵解途径形成丙酮酸,丙酮酸在乙酰羟酸合酶的作用下进入氨基酸的生物合成途径,在合成代谢的最后阶段形成α-酮酸中间体,进一步在相应酶的催化作用下形成相应的高级醇[38]。

3.1.1 2-苯乙醇的合成

3.1.1.1 莽草酸途径(Shikimate pathway) 莽草酸途径是酿酒酵母从头合成2-苯乙醇的代谢途径:磷酸烯醇式丙酮酸(来源于糖酵解途径)和4-磷酸赤藓糖(来源于磷酸戊糖途径)经4步酶促反应生成莽草酸,莽草酸经一系列酶促反应生成苯丙酮酸,在苯丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶作用下最终生成2-苯乙醇(图1)[40-41]。酿酒酵母通过此途径合成2-苯乙醇的代谢途径长、支路多,在加上多种抑制作用的存在,合成2-苯乙醇的产量很低,一般仅为400～500 mg/L[41]。

图1 酵母菌合成2-苯乙醇的代谢途径[40]Fig.1 The metabolic pathways of 2-benzene ethanol in yeast[40]

3.1.1.2 埃尔利希途径(Ehrlich pathway) 陈先锐等[41]综述中提到当培养基中以L-苯丙氨酸(L-Phe)作为唯一氮源时,酵母菌主要通过艾氏途径合成2-苯乙醇:经芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅰ或Ⅱ的催化作用,L-Phe经转氨酶作用生成苯丙酮酸,其氨基转移到α-酮戊二酸生成L-谷氨酸,苯丙酮酸经苯丙酮酸脱羧酶作用生成苯乙醛,苯乙醛在醇脱氢酶作用下生成2-苯乙醇(图2)[40]。当培养基中还有其他物质作为氮源时,即使L-Phe浓度很高,也不可能完全转化为2-苯乙醇,其中一部分L-Phe会通过其他途径被代谢,如通过肉桂酸途径进入TCA循环,这个降解途径不能完全被抑制[42-43]。

图2 艾氏途径合成2-苯乙醇[40]Fig.2 Synthesis of 2-phenylethyl alcohol by Ehrlich pathway[40]

3.1.1.3 关键酶和相关基因 糖酵解途径是微生物细胞中迄今为止研究的最为清楚透彻的代谢途径[44]。在糖酵解途径中以葡萄糖为起始物生成磷酸烯醇式丙酮酸共经过了9步反应[45]。在酿酒酵母中已经确定有20个不同的基因和己糖转运相关,其中Hxt7和Hxt6为高亲和力的葡萄糖转运蛋白;HXT7长度为570个氨基酸,具有12个跨膜结构域,在高浓度葡萄糖条件下它被强烈压抑[46]。

葡萄糖通过转运系统进入细胞后,首先在ATP和Mg2+共同参与下被己糖激酶(HK)催化,磷酸化成6-磷酸葡萄糖,这一反应活化了葡萄糖,利于它进一步参与合成分解代谢,同时也避免了葡萄糖逸出细胞[44]。Lagunas R和Moreno E[47]研究2-脱氧半乳糖对糖酵解的抑制作用时发现,2-脱氧半乳糖主要抑制己糖激酶和磷酸果糖激酶。在酵母细胞中,参与己糖磷酸化的己糖激酶有PⅠ和PⅡ,分别含有HXK1和HXK2基因[48]。葡萄糖的磷酸化,糖酵解的第一个不可逆转的步骤。Williamson T[49]通过研究发现己糖激酶(HK)编码基因(HXK1和HXK2)的缺失导致糖酵解振荡的持续时间更长,幅度更小,而且缺失HXK2对振荡时间的影响比HXK1更强。

磷酸果糖激酶长期以来一直被认为是酵母糖酵解振荡的关键调节器,它是由4个由PFK1编码的和4个由PFK2编码的亚基组成的复杂杂异寡糖酶[49]。Williamson等[49]通过基因删除技术分别测试了PFK1和PFK2对糖酵解振荡的影响,结果发现删除PFK1导致振荡频率略有下降,而删除PFK2则可完全消除振荡。Nakajima等[50]研究发现除磷酸果糖激酶基因(pfkB)外,米曲霉大部分的糖酵解基因都由培养基中的葡萄糖诱导表达,而在酿酒酵母中,葡萄糖的存在会诱导PFK1和PFK2的表达;他们还发现米曲霉磷酸果糖激酶的两个多肽和酿酒酵母的多肽相比,其N-端大约少200个氨基酸。

Gap1p是转运芳香族氨基酸进入细胞的主要通透酶。培养基中存在优质氮源(如谷氨酰胺和氨)时,由于氮代谢物阻遏作用,GAP1的表达被抑制,质膜上的Gap1p失活;当培养基仅有贫乏氮源(如脯氨酸、尿素和芳香族氨基酸)时,GAP1被诱导表达,Gap1p恢复转运活性。当L-Phe为唯一氮源时,Ssy1p首先接受L-Phe的信号,并诱导GAP1表达和Gap1p恢复活性,Gap1p将L-Phe转运至胞内,参与细胞的代谢活动[41]。

在酿酒酵母中存在两种同工酶,即芳香族氨基酸氨基转移酶Ⅰ和Ⅱ,两者同属于第一家族氨基转移酶类,分别由ARO8和ARO9基因编码。Aro8p能够催化与芳香族氨基酸代谢相关的绝大部分转氨反应,而且对甲硫氨酸、α-氨基己二酸和亮氨酸的转氨反应也有催化作用。在优质氮源条件下细胞不表达ARO9基因,在仅含贫乏氮源或者ARO8基因无法表达的情况下,ARO9经苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等诱导进行表达,产生芳香族氨基酸氨基转移酶II[41]。

酿酒酵母基因组中含有5个可能编码苯丙酮酸脱羧酶活性的基因,只有ARO10基因在不同氮源的条件下的转录水平有较大改变,当以L-Phe为唯一氮源时,艾氏途径中苯丙酮酸脱羧酶主要是由ARO10基因编码;Aro10p的底物范围较广,主要参与芳香族氨基酸转氨反应产物的脱羧反应[41,51]。

在酿酒酵母中共发现6个脱氢酶基因与2-苯乙醇的合成相关,其中ADH1、ADH2、ADH3、ADH4和ADH5这5个为乙醇脱氢酶基因,SFA1为甲醛脱氢酶基因,Adh1p-Adh5p或者Sfa1p任何一种酶都可以独自完成艾氏途径中最后一步由醛脱氢形成高级醇的催化反应[52]。

3.1.2 异戊醇的合成 异戊醇主要经由Ehrlich途径合成,原料中的蛋白质、氨基酸在酵母分泌的转氨酶、脱羧酶和醇脱氢酶的作用下可分解产生异戊醇[53]。Atsumi等[54]利用13C核磁共振波谱法和气质联用进行试验,最早报道了异戊醇可以通过亮氨酸代谢得到,且这个代谢过程中关键的丙酮酸脱羧酶由酿酒酵母的YDL080c基因编码。该方法合成异戊醇的优点是利用蛋白质等非糖类物质作为原料进行发酵,可以提高原料的利用范围;缺点是产物少而复杂,难以有效分离,不利于大规模生产[53]。

3.2 羧酸类化合物的合成

挥发性脂肪酸主要来源于酒精发酵过程,Blochh和Lynen最早发现乙酰辅酶A与脂肪酸代谢有关。在酵母代谢过程中,乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A发生反应,主要生成偶数直链饱和脂肪酸类化合物(含有4～18个碳原子),而其他一些含量较少的不饱和脂肪酸和奇数碳原子的脂肪酸,其合成与否受发酵条件的影响[5,55]。

相关研究表明,酿酒酵母细胞产生乙酰辅酶A最主要的代谢途径有两个:a、丙酮酸代谢支路,又称酮酸代谢旁路,丙酮酸经过丙酮酸脱羧酶(PDC)、乙醛脱氢酶(ALD)、乙酰辅酶A合成酶(ACS)的催化作用形成乙酰辅酶A;b、丙酮酸脱氢酶途径,在有氧和线粒体存在条件下,丙酮酸经过丙酮酸脱氢酶复合酶(丙酮酸脱氢酶E1、二氢硫辛酰胺转乙酰酶E2、二氢硫辛酰胺脱氢酶E3)催化作用,发生氧化脱羧反应形成乙酰辅酶A[56-57]。酿酒酵母中乙酰辅酶A主要源于丙酮酸代谢旁路,其中编码乙酰辅酶A合成酶的结构基因有两个:ACS1和ACS2,ACS1对非葡萄糖碳源的代谢具有非常重要的作用,而在缺氧和葡萄糖浓度过高时，表达会受到明显抑制;ACS2是酿酒酵母以葡萄糖为碳源进行生长和繁殖所必需的基因,在细胞内为组成型表达[58]。酿酒酵母细胞中主要由乙酰辅酶A水解酶催化乙酰辅酶A的降解过程,此过程受到葡萄糖的抑制[59]。

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在脂肪酸合成和代谢过程中起着重要作用,能够催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A,这是脂肪酸合成代谢的第一步反应,也是限速反应[60]。丙二酸单酰辅酶A是长链脂肪酸合成的重要底物,在脂肪酸的合成中作为C2单位的供体,并且在脂肪酸的氧化中作为线粒体穿梭系统的调节因子[61]。对于大多数生物来说ACC是一个必需酶,缺少ACC对酵母的生物组织来说是致命的,而脂肪酸合酶(FAS)的缺失不会造成致死影响,只要在培养基中添加必需脂肪酸便可继续存活[60]。ACC分为两大类:第一大类为异质型ACC,即多亚基型,存在于细菌、大多数植物(不包括禾本植物)的质体中,大肠杆菌的ACC是第一类中的典型代表;第二大类ACC为同质型ACC,即多功能型,大多数植物的胞质溶胶、人类和大多数真核生物的ACC属于这一类[60]。目前仅有研究动物[60,62]、植物[63]体内与ACC相关基因的报道,而微生物体内与ACC相关基因的研究尚未见报道。

3.3 酯类化合物的合成

国外学者发现酯类化合物的形成途径有两条:一条是酸和醇类化合物在酯酶的催化下脱水缩合形成酯,此途径发生于酒的陈酿期,反应极其缓慢,如酒石酸乙酯、琥珀酸乙酯等的生成,另一条是酰基辅酶A在醇酰基转移酶(AATFase)的作用下和相应的醇类化合物化合形成酯,此为酒中酯类化合物形成的主要途径,如常见的乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯等[64-68]。esterase和lipase都属于酯酶,既能合成酯类化合物又能水解酯类化合物,其中esterase催化短链脂肪酸合成酯,而lipase催化中长链脂肪酸合成酯[64,68]。

郭建华等[69]研究发现在白酒酒醅发酵过程中,酶的种类和酯类物质的生成具有重要的相关性:总酯的生成与糖化酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶相关性显著,其中脂肪酶与乙酸乙酯的生成显著相关,糖化酶和脂肪酶与乳酸乙酯的生成显著相关。

3.3.1 乙酯类的合成 乙醇和短链或中链脂肪酸可作为乙酯类化合物的合成底物。在酒精发酵过程中,通过细胞质中脂肪酸合成酶复合体的作用,酵母细胞中的短链和中链脂肪酸被释放出来,并在酰基转移酶(acyltransferase)的催化作用下和乙醇生成相应的乙酯类化合物[70]。酵母中催化乙酯合成的酰基转移酶主要是乙醇酰基转移酶(Eeb1)和乙醇己酰转移酶(Eht1),分别由EEB1和EHT1基因编码。其中Eeb 1在乙基酯的合成中起主要作用,而Eht1则主要催化乙醇和己酰辅酶A生成己酸乙酯。研究者研究发现Eeb1和Eht1的过量表达并没有使乙基酯的含量明显增加,表明Eeb1和Eht1并不是乙基酯合成的限速酶[70-71]。

3.3.2 乙酸酯类的合成 在酵母细胞内,乙酸酯的合成底物是乙醇或高级醇和酰基辅酶A(acyl coenzyme A,acyl-CoA),它们在醇乙酰基转移酶(AATase)的催化作用下生成相应的乙酸酯。酵母细胞内的醇乙酰基转移酶有Atf1、Lg-Atf1和Atf2,三者的编码基因分别为ATF1、Lg-ATF1和ATF2,其中Atf1和Atf2在酿酒酵母和巴氏酵母中都存在,而Lg-Atf1只在巴氏酵母中存在[70,72]。在这些酶中,Atf1对于乙酸酯的合成最为重要,在发酵过程中,通过调控ATF1的表达,乙酸酯的生成量变化明显[73]。氧气和不饱和脂肪酸均有抑制酵母中醇酰基转移酶活性的作用,其中不饱和脂肪酸可以不受氧气的影响单独调控ATF1基因的转录[74],棕榈油酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸均具有此调控作用[74-75]。也有研究表明,酵母细胞中的酯酶也与乙酸酯的合成有关,其编码基因是IAH1;此外,酯酶还可水解乙酸酯,且其水解乙酸酯的速率明显高于合成乙酸酯的速率[70]。

4 展望

苹果酒香气成分复杂,每种香气都会对苹果酒总体香气产生不同程度的影响,但是具有高香气活性值(Odor activity value,OAV)的关键香气成分主要决定着苹果酒香气的风格和特征,这些关键特征香气成分或其前体物质主要在发酵过程中生成,因此加强苹果酒发酵过程中关键特征香气的生成机制与控制方法的研究尤为必要。随着现代分析技术和代谢组学的高速发展,果酒的香气分析和评价方法已经逐渐成熟,苹果酒的香气代谢研究目前已经成为热门的研究课题。高级醇、酯类是影响苹果酒风味的主要成分,但从研究者们对苹果酒香气物质的影响因素和代谢途径研究来看,主要集中在醇类物质的研究上。目前代谢途径研究的较为透彻的是2-苯乙醇,其次是异戊醇,对于其他的醇类物质的代谢途径研究还处于探索阶段,对于苹果酒中酯类、羧酸类等其他物质的研究很少。今后要对我国苹果酒的关键香气成分及其代谢机理继续进行探索;通过开展更加深入的酿酒酵母代谢过程的研究,找到其代谢过程中的关键酶类和相关基因,并通过基因工程等技术改良酵母的酿酒特性,找到其合成过程的中间产物及酶类、探明其代谢机制,以便更好地控制苹果酒香气形成,生产出符合消费者需求的各类香气风格的苹果酒。