多孔钛片表面ZnO薄膜的表征 及其对腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制性能

魏旭青,段长平,3,刘连利,徐姝颖,李秋莹,孙 彤,*,励建荣,*

(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121013; 2.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 3.中核四〇四有限公司,甘肃兰州 730000; 4.渤海大学实验管理中心,辽宁锦州 121013)

在食品、印染及其它工业生产中,生物被膜会引起食品品质及生产设备损伤[1-3]。研究发现,生物被膜可导致细菌病原体的持续生长及食品的交叉感染[4-5],其污染的产品会引发疾病,危害人体健康[6-8]。同时,生物被膜可粘附于食品、食品加工设备及食品贮藏容器的表面[9],造成食品腐败、设备表面受损及运转能耗增加[10-11]。由于生物被膜具有复杂的内部环境,虽然表面的细菌易被抗生素杀死,但被膜细菌却对抗生素不敏感,增加了抗生素的杀菌难度,从而降低其抗菌、杀菌作用[12-15]。因此,如何有效抑制材料表面生物被膜的形成及生长，成为当前研究的热点之一。

目前应用较多的无机抗菌材料包括银系抗菌材料[16-17]、TiO2光催化抗菌材料[18-19]、载铜抗菌材料[20]等。ZnO作为一种无机抗菌材料,具有活性高、稳定性好的特点,同时具有良好的抑菌能力,已应用于多个行业[21]。制备ZnO的液相方法主要有直接沉淀法[22-23]、水热合成法[24-25]、溶胶凝胶法[26-27]等。其中,水热合成法因其工艺简单、颗粒形态尺寸可控及易于实现产业化而被广泛应用[28-29]。研究表明,纳米ZnO对细菌生物被膜的形成和生长均具有抑制性能[28-30]。Shams等[29]发现，ZnO纳米粒子可以抑制口腔致病菌的生物膜形成,其释放出的Zn2+和产生的活性氧可以破坏细菌的细胞壁和细胞膜,从而达到杀菌的目的。同时,Rajendra等[30]发现ZnO纳米粒子可以抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。

腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)是冷藏海水鱼类的优势腐败菌,具有较强的致腐活性[31],能粘附于食品及容器表面，形成生物被膜[32],从而使食品腐败加剧。因此,本实验选用腐败希瓦氏菌为抑菌对象。由于ZnO纳米粒子的微观形貌影响其抑制生物被膜的性能[33-35],本文为获得具有不同微观结构的ZnO薄膜,以阳极氧化法制备的多孔钛片为基底,在真空辅助条件下,采用水热合成法制备纳米ZnO薄膜,研究水热反应时间对ZnO薄膜微观结构及其对腐败希瓦氏菌生物被膜抑制性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腐败希瓦氏菌(ATCC8071) 美国微生物菌种保藏中心,实验室保藏;LB肉汤、LB营养琼脂 以上合成培养基均购自青岛高科园海博生物技术有限公司;实验所用试剂 均为分析纯(AR);0.2 mm厚的高纯钛箔(99.99%) 清河县佳润金属材料有限公司;3 mm厚高纯石墨片 天津亚达电机配件厂。

WU800型角磨机 宝时得机械(中国)有限公司;SK8210HP型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司;MS605D型直流稳压电源 东莞市迈豪电子科技有限公司;DF-Ⅱ型集热式磁力加热搅拌器 江苏省荣华仪器制造有限公司;LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;LRH型系列生化培养箱 上海一恒科技有限公司;SW-CJ-2FD型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;PL602-L型电子天平 梅特勒-托利仪器有限公司;Rigaku Ultima IV型X射线粉末衍射仪 日本理学公司;S-4800型场发射扫描电子显微镜 日本日立公司;OCA15EC型接触角测量仪 北京东方德菲仪器有限公司;Victor X3型酶标仪 上海珀金埃尔默仪器有限公司。

1.2 多孔钛片及其表面ZnO薄膜的制备和表征

1.2.1 阳极氧化法制备多孔钛片 以钛片为阳极,等面积石墨为阴极,在电极间距4.0 cm,电压40.0 V条件下，于0.4%(V/V)氢氟酸(HF)电解液中，采用阳极氧化法处理钛片60 min,分别用去离子水、乙醇清洗,120 ℃烘干 2 h,得孔径约为50 nm的多孔钛片[36]。

1.2.2 水热合成法制备ZnO薄膜 将0.3 mol/L的Zn(CH3COO)2溶液和同浓度盐酸羟胺溶液等体积混合后,加入0.1% wt的六偏磷酸钠作为表面活性剂。在真空度为0.08 MPa条件下,将3 cm×1 cm多孔钛片置于上述溶液中,浸渍20 min后转入高压反应釜中,填充率80%,150 ℃反应2、12和24 h,自然冷却后取出,室温陈化24 h,100 ℃干燥12 h,480 ℃煅烧2 h,得ZnO薄膜样品[37]。

1.3 多孔钛片及ZnO薄膜材料表征分析

采用X射线粉末衍射仪对样品进行晶型分析(CuKα辐射,40 kV,50 mA,步宽0.02°,扫描速度4 °/min)。采用场发射扫描电子显微镜，对样品进行微观形貌表征。运用切线法,采用接触角测量仪，测定薄膜的水接触角。

1.4 材料表面腐败希瓦氏菌生物被膜附着性能测定

活化后OD值约0.5的腐败希瓦氏菌的菌悬液按1∶200稀释,吸取稀释好的菌悬液1 mL于无菌离心管中,放入基片,即带有ZnO薄膜的多孔钛片,28 ℃培养2、4、8、12、24、36和48 h后取出,测定其表面生物被膜的性能指标[38]。

1.4.1 钛片及ZnO表面生物被膜粘附性能及被膜菌生长曲线测定 取出上述基片于无菌离心管中,1 mL 0.9%生理盐水洗两次以去除浮游菌,加入1 mL 1.0%结晶紫染色5 min,1 mL生理盐水洗2次去除浮色,加入33%(V/V)冰乙酸0.2 mL脱色10 min,吸取脱色后溶液200 μL于96孔板中，用酶标仪测定OD595,表征生物被膜的粘附性能。

取上述基片,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4,KH2PO40.27 g,Na2HPO41.42 g,NaCl 8 g,KCl 0.2 g,加去离子水定容到1 L)冲洗3次,去除浮游菌,放入10 mL PBS中,于53 kHz、25 ℃条件下超声处理10 min。梯度稀释菌悬液,采用平板计数法测定生物被膜上腐败希瓦氏菌的菌落数量,绘制其生长曲线。

1.4.2 生物被膜微观形貌观察 上述基片用无菌水冲洗3次,放入4 ℃预冷的2.5%(V/V)戊二醛中浸泡4 h,取出后分别在30%、50%、70%、90%(V/V)的乙醇中浸泡30 min,在无水乙醇中浸泡两次,每次30 min,取出后于超净台内自然风干。样品喷金后,用场发射扫描电子显微镜观察其微观形貌。

1.5 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2007处理实验数据,采用Origin8.0软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 多孔钛片及ZnO薄膜的表征分析

2.1.1 ZnO薄膜的XRD表征分析 ZnO的晶型和结晶状态影响ZnO薄膜的抗菌性。Shams等[39]发现纳米粒子的形状影响生物被膜的形成,Dutta等[40]发现不同的结晶状态影响其抗菌性。与ZnO薄膜同时制备粉体的XRD表征结果表明,样品为六方纤锌矿结构ZnO晶体(JCPDS card No.36-1451),2θ角31.9°、34.5°、36.3°、47.6°、56.7°、62.9°和68.1°处的衍射峰分别对应于ZnO晶体的(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)和(112)晶面。由图可见,衍射峰峰形尖锐,说明样品结晶度好,无杂相峰,样品纯度高。

图1 ZnO薄膜的XRD谱图Fig.1 XRD patterns of the ZnO films

2.1.2 多孔钛片及ZnO薄膜的SEM表征分析 由图2可见,经阳极氧化处理后,获得孔径约50～60 nm均匀排列TiO2孔洞的多孔钛片(图2(a)),水热反应2 h得到的薄膜表面ZnO总量较小,且ZnO颗粒首先附着在TiO2多孔膜的孔道顶端及边缘,并沿着骨架纵向堆积(图2(b))。说明在水热反应高温高压条件下,过饱和的锌在多孔钛片孔道顶端的TiO2晶体表面沉积,形成ZnO晶体。水热反应12 h所得的薄膜表面上ZnO密集堆积,附着量明显增大,在多孔钛片表面形成一层密集的ZnO薄膜,但表面粗糙,ZnO无序堆积使薄膜分布不均匀(图2(c))。水热反应24 h所得薄膜表面ZnO有序堆积,附着量继续增大,表面ZnO颗粒分布更加均匀(图2(d))。说明随着水热反应时间延长,ZnO晶体继续沉积,材料表面的孔道被ZnO晶体颗粒充满。受孔道导向作用的影响,继续生长的ZnO晶体沿固定方向有序生长,形成有序、均匀的多层结构。

图2 多孔钛片及不同水热反应时间 制备的ZnO薄膜扫描电镜图Fig.2 SEM images of the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)多孔钛片;(b)ZnO薄膜2 h;

2.1.3 多孔钛片及ZnO薄膜表面亲疏水性表征分析 根据检测的接触角的大小,可以将测试材料的亲疏水性能分为以下三种:接触角<90゜为亲水性,90゜<接触角<150゜为疏水性,接触角>150゜为超疏水性[41]。由表1可见,多孔钛片呈疏水性,ZnO薄膜均呈亲水性,水热反应时间越长,样品的亲水性越强。分析认为,由于纳米管的存在,多孔钛片与水接触时,水滴无法与基底直接接触,而与纳米管及纳米管中的空气接触,液滴与气体接触面积占比较大,故表现出较好的疏水性。由于纳米ZnO粒径小,且颗粒表面有毛细孔水和表面吸附水,其比表面积和表面能较大,使其亲水性增强。随着水热时间延长,ZnO沉积量增大,薄膜表面能继续增大,接触角减小,材料表面亲水性增强。

表1 多孔钛片及不同水热反应时间 制备的ZnO薄膜的水接触角Table 1 The water contact angles of the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time

2.2 材料表面腐败希瓦氏菌生物被膜附着性能研究

2.2.1 材料表面腐败希瓦氏菌生物被膜粘附率及被膜菌生长曲线 由图3可见,0～2 h,材料表面腐败希瓦氏菌生物被膜粘附率和被膜菌总数上升很快,表明生物被膜从最初的可逆附着转化为不可逆附着,生物被膜经历了生化作用阶段和菌体附着阶段,且菌体在生物被膜内迅速繁殖。2～12 h,材料表面生物被膜粘附率及被膜菌菌落总数持续增长,即生物被膜进入生长阶段。12～36 h,被膜粘附率及被膜菌菌落总数变化较小,说明生物被膜进入成熟期,基片表面附着的多糖和蛋白质为细菌提供营养,使被膜菌数量持续增加。36 h后,材料表面生物被膜粘附率和被膜菌总数下降,生物被膜进入衰退期。

图3 多孔钛片及不同水热反应时间制备的 ZnO薄膜表面生物被膜生长情况Fig.3 The growth states of the biofilms on the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)生物被膜粘附率;(b)被膜菌生长曲线。

由图3(a)可见,ZnO薄膜表面生物被膜粘附率均低于同期多孔钛片表面的被膜粘附率,且水热反应时间越长,所制备的ZnO薄膜表面的被膜粘附率越低。由图3(b)可见,材料表面被膜菌生长规律与生物被膜的粘附率呈正相关,即ZnO薄膜的抗生物被膜性能优于多孔钛片,且ZnO附着量越大,ZnO薄膜抗生物被膜性能越优。分析认为,根据ZnO的离子溶出机理,ZnO薄膜上附着了生物被膜后,Zn2+溶出进入生物被膜中,与被膜菌的菌体蛋白酶结合,使之失去活性,从而使细菌死亡[42]。部分被膜菌死亡后,其分泌胞外多糖等被膜粘附物质的能力下降,因此ZnO薄膜的抗生物被膜性能优于多孔钛片。前期研究表明,材料表面疏水性提高有利于其抗生物被膜性能提高[33],但本研究中多孔钛片的疏水性并未降低其表面生物被膜的粘附性能,包括被膜初始生长阶段的粘附率。而被膜的初始粘附率及各时期粘附率均与ZnO的附着量呈正相关。说明ZnO薄膜对生物被膜中被膜菌的杀菌性能在抗生物被膜性能中的贡献远高于材料表面的疏水性。比较各ZnO薄膜,水热反应时间越长,ZnO颗粒在材料表面的附着量越大,虽然其表面的多孔结构消失,且亲水性更强,但其抗生物被膜性能更优,进一步说明ZnO薄膜的抗菌性决定了其抗生物被膜性能。由图3(a)可见,ZnO薄膜上生物被膜的粘附率下降略早于多孔钛片,这是由于被膜菌被杀死后，其分泌胞外多糖等粘附物质的能力下降所致。

2.2.2 材料表面腐败希瓦氏菌生物被膜微观形貌分析 由图4可见,在生物被膜培养2 h后,多孔钛片及ZnO薄膜表面形成了粘附多糖及蛋白质膜,说明此阶段生物被膜处于最初的粘附阶段。12 h时,材料表面的胞外多糖膜增厚,多孔钛片表面的生物被膜基本铺满,甚至有的将菌体包裹其中,此时生物被膜处于生长期。36 h时,可见粘附多糖形成的连续膜部分脱落,且部分细菌细胞受损,说明生物被膜经历生长期并开始进入衰退期。48 h后,生物被膜大部分脱落,且可见部分不完整菌体,此时为生物被膜的衰退期。比较同期各材料表面的生物被膜,多孔钛片表面的生物被膜粘附物较多,ZnO薄膜表面的被膜粘附物和菌体数量较少,与材料表面生物被膜粘附率及被膜菌生长曲线的实验结果一致。

图4 多孔钛片及不同水热反应时间制备的ZnO薄膜表面生物被膜的扫描电镜图Fig.4 SEM images of the biofilms on the porous titanium sheet and ZnO films prepared after different hydrothermal time注:(a)多孔钛片;(b)ZnO薄膜水热2 h;(c)ZnO薄膜水热12 h;(d)ZnO薄膜水热24 h; 生物被膜培养不同阶段:(1)2 h;(2)12 h;(3)36 h;(4)48 h。

3 结论

在水热反应过程中,ZnO首先在多孔钛片TiO2孔的孔道顶端及边缘沉积,随着水热反应时间延长,TiO2孔道被ZnO晶体颗粒充满,继而形成有序、均匀的多层结构,且附着量明显增大。多孔钛片呈疏水性,ZnO薄膜呈亲水性,且随水热时间的延长,其亲水性增强。由于ZnO具有杀菌性能,ZnO薄膜对腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制性能增强,且水热反应时间越长,其对腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制性能更优。

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