LncRNA HAGLR表达与前列腺癌预后的相关性分析

向宸辉，刘小勇，陈胜龙，王鹏桥

前列腺癌（PCa）是男性群体中最高发的恶性肿瘤，同时也是发达国家第2大致死性肿瘤[1]。绝大多数的PCa患者可在早期诊断后，实施包括根治性前列腺切除术等治疗，可获得较好的治疗效果[2]。然而，仍然存在部分患者术后肿瘤复发的情况，其表现为持续性的前列腺素特异抗原（PSA）的水平持续上升或出现肿瘤远端转移。因此，研究与PCa复发有关的分子生物学机制，寻找与PCa复发相关的重要生物标志物，是目前治疗PCa的关键。

长链非编码RNA（LncRNA）为长度大于200 nt的非蛋白编码的RNA，其编码基因广泛存在于生物基因组中，并在多种基因的调控中发挥重要作用[3-4]。其中，HAGLR是目前研究较多的LncRNA之一，其编码基因位于2号染色体长臂，属于HOX基因家族成员，是调控生长发育的重要基因[5]。有研究表明，HAGLR参与肿瘤的发生及转移过程，并与患者的预后紧密相关，可能作为评估肿瘤患者预后的潜在生物学指标[6-7]。

本次研究采用实时荧光定量PCR技术（qRTPCR），检测HAGLR在前列腺癌及癌旁组织中的表达差异，并分析HAGLR与患者临床病例资料和预后的关系，以探讨HAGLR与前列腺癌发病的相关性及其作为前列腺癌患者预后生物标记物的可能。

1 资料与方法

1.1 资料来源 收集2009年1月～2011年12月于笔者科室行手术切除并保存的PCa组织和配对瘤旁正常前列腺组织标本共96份，以及患者的临床病例资料，包括年龄、Gleason评分、肿瘤分期、术前血清PSA浓度、内分泌治疗情况、术前放疗、预后等。所有PCa组织及配对癌旁组织于术中切除后立即放于液氮中速冻，后转入-80℃保存，用于qRT-PCR逆转录聚合酶链实验；患者随访时间为术后至2017年12月31日。

1.2 HAGLR表达水平检测 取100 mg冻存PCa组织或配对瘤旁正常前列腺组织标本，放入研磨器中，加入1 ml Trizol液，研磨后静置5 min，提取总RNA。取5 μl总 RNA，行琼脂糖凝胶电泳，以检测RNA完整性。按照逆转录试剂盒（Takara公司）说明书方法，用以合成cDNA，后放于-80℃保存。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。参考SYBR GreenⅠ（美国Thermo Fisher公司）说明书配制反应体系，取cDNA进行qRT-PCR。qRT-PCR结果解读：△Ct=样本 Ct平均值-内参 Ct平均值；△△Ct=△Ct-（阴性对照样品 Ct平均值-内参 Ct平均值）；2-△△Ct表示基因相对表达量。

1.3 统计学方法应用SPSS 19.0软件分析数据，计量资料以±s表示比较，采用t检验；计数资料以频数和百分率表示，采用χ2检验；Kaplan-Meier法分析生存差异，组间比较采用Log-rank法；Cox回归分析复发相关因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本临床资料 共纳入96例PCa患者，平均年龄（63.80±8.79）岁；PSA 浓度＜10 ng/ml者80例、≥10 ng/ml者16例；Gleason评分＜7分者55例，≥7分者41例；8例于术后行内分泌治疗，2例术后行放射治疗；76.0%患者处于TNMⅠ期。见表1。

患者基本临床资料（n=96）

表1

2.2 HAGLR表达与患者临床病例特征的相关性

qRT-PCR检测结果显示，肿瘤组织HAGLR表达水平显著高于癌旁正常前列腺组织（P＜0.01）。见图1。

2.3 HAGLR表达与患者预后的相关性 Log-rank检验结果显示（图2），HAGLR的表达水平会影响PCa患者的无复发生存率（RFS）；Cox回归分析显示，Gleason评分≥7、TNM分期为Ⅱ～Ⅳ期、HAGLR高表达均是影响PCa患者RFS的独立危险因素（P＜0.05）。

图1 PCa及癌旁组织HAGLR检测结果

图2 不同HAGLR表达水平PCa患者RFS比较

3 讨论

随着基因组学研究的不断深入，了解到基因组序列中只有2%的基因被翻译成蛋白质，而大部分基因被转录为非编码RNA[10]。作为非编码RNA重要的一环，LncRNA曾被认为是基因组转录的噪声，无生物学功能，但许多研究发现，LncRNA与多种肿瘤密切相关。在肝癌中，LncRNA TSLNC8通过竞争性地与转酮醇酶（TKT）以及信号传导与转录激活因子3（STAT3）相结合，介导STAT3磷酸化及其编码基因的转录活性，抑制IL-6/STAT3信号通路，从而影响肝癌细胞的增殖[11]。在肺癌中，LncRNA IGFBP4-1通过调控肿瘤细胞的能量代谢过程，影响肺癌细胞的增殖与侵袭能力[12]。这些研究结果表明，LncRNA具有成为肿瘤治疗潜在靶点的可能。

HOX基因在肿瘤细胞各种生理过程中发挥着重要的作用，如调控细胞凋亡、受体信号转导和细胞分化[13]。HAGLR作为HOX基因家族成员之一，同样参与肿瘤的调控。目前的研究显示，HAGLR在神经胶质瘤、膀胱癌、胃癌等多种肿瘤中表达上调[6，14，15]。 而干扰 HAGLR 的表达，能显著抑制肿瘤细胞系的增殖，证明其促癌基因的角色。目前研究发现，其致癌作用存在多种机制，Li等[15]发现，在胃癌细胞系，HAGLR的表达明显上升，而通过抑制HAGLR表达，发现酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）与STAT3的磷酸化水平明显下降，提示HAGLR通过JAK2/STAT3通路促进胃癌细胞的增殖与迁移。同时有报道[7]，HAGLR可通过调节脂酸合成酶的活性，而诱导非小细胞肺癌（NSCLS）的发生。

本研究发现，PCa肿瘤的HAGLR表达水平显著高于癌旁组织，推测其与前列腺癌的发生发展过程相关。通过比较不同临床病例特征患者的HAGLR表达水平，发现HAGLR的表达与Gleason评分（＜7 vs.≥7）、伴或不伴有血管侵犯以及不同TNM分期有关，Gleason评分越高，发生血管侵犯，TNM分期越高，HAGLR的表达水平也明显增高，而与血清PSA浓度、包膜外侵犯及淋巴转移无关，提示HAGLR与肿瘤的增殖分化相关。此外，生存分析结果显示，HAGLR的表达与患者的RFS高度相关，低表达HAGLR的患者的RFS明显优于高表达HAGLR的患者，表明HAGLR与PCa患者术后复发高度相关。进一步Cox回归分析显示，Gleason评分≥7、TNM分期为Ⅱ～Ⅳ期、HAGLR高表达是影响PCa患者RFS的独立危险因素。以上结果提示，HAGLR可作为判断PCa患者复发的生物学指标。

综上所述，HAGLR的表达水平显著高于癌旁组织，且与PCa患者的预后密切相关；HAGLR可作为评估PCa患者预后的潜在指标，检测HAGLR有助于PCa早期复发的诊断，对发现PCa的治疗新靶点及预后评估方法提供了新思路。