干酪乳杆菌与嗜热链球菌组合发酵羊奶饮料的加工工艺

刘晓，姜竹茂，余志坚，周梅，张颂，刘花兰，刘婕

（1烟台大学，山东 烟台 264005；2东君乳业（禹城）有限公司，山东 禹城 251200）

0 引 言

山羊奶中富含200多种营养素和生物活性物质[1]，被视为乳中精品。它具有独特的保健功效，有养颜美容、抗衰老等功效。干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受有机体的防御机制[2]。在进入人体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠道菌群平衡、促进人体消化吸收的作用[3]。干酪乳杆菌与嗜热链球菌组合发酵羊奶饮料，不仅降低羊奶膻味，深受消费者喜爱；而且它具有抗衰老、延年益寿、促进消化道蠕动，减少便秘等功效。

目前，国内关于发酵型羊奶饮料的文献较少，秦立虎[4]等人以新鲜羊奶为主要原料经乳酸菌发酵,添加樱桃果汁等配制樱桃活性乳酸菌羊奶饮料。在美国、日本、韩国以及台湾地区，该产品工业化较多，尤其以养乐多为代表，在台湾地区该类型产品几乎与酸奶市场份额相当，近几年国内该类型产品的产量逐年上升，养乐多、味全、蒙牛等公司都先后推出自己的褐色乳饮料，可见其市场前景良好[5]。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 材料

干酪乳杆菌，嗜热链球菌，脱脂奶粉，全脂羊奶粉，白砂糖，高脂果胶，蔗糖酯，羧甲基纤维素钠（简称CMC）。

1.1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅、超净工作台、电热恒温培养箱、电子分析天平、台式离心机、pH计等。

1.2 工艺流程

1.3 操作要点

（1）菌种活化[6]。将脱脂奶粉用蒸馏水配制成12%的复原乳，在115℃灭菌15 min，冷却至40℃，在无菌条件下，分别接种干酪乳杆菌和嗜热链球菌，在恒温培养箱中培养至凝乳。干酪乳杆菌发酵剂和嗜热链球菌发酵剂培养温度分别为37℃和42℃，进行3次活化使其活力充分恢复后，即可作为酸奶发酵剂。

（2）脱脂[7]。利用离心旋转的方法进行脱脂，转速是2 000 r/min离心20 min脱脂。

（3）均质[8]。均质压力18～20 MPa，温度为50℃。

1.4 测定方法

1.4.1 酸度的测定[9-10]

测定方法参考《GB5413.34-2010》。测定时用浓度为0.1 mol/L的NaOH滴定法，吉尔涅尔度°T表示。

1.4.2 乳酸菌活菌数的测定[11]

测定方法参照《GB4789.2-2010》，利用平板计数法对发酵酸乳中活菌数进行测定。发酵的羊奶饮料用灭菌的0.9%的生理盐水梯度稀释，当稀释到一定的倍数后，取0.1 mL的菌液在MRS培养基涂布计数，37℃培养48 h，菌落计数法计算活菌数量[12-13]。

1.4.3 沉淀离心率的测定[14]

在10 mL离心管中加入添加羊奶饮料，置于离心机中以3 000 r/min离心10 min，根据以下公式计算离心沉淀率：

1.4.4 感官评价[15]

选择10名从事食品专业研究的人员组成评定小组，对发酵型酸羊奶饮料的感官质量从色泽、滋味、气味、稳定性4个方面评定，评分标准如表1所示。

表1 产品感官评定标准

2 结果与讨论

2.1 原料乳杀菌工艺的确定

羊奶中的蛋白质等氨基化合物和葡萄糖或其他羰基化合物之间在正常的状态下并不会发生美拉德反应，只有当热处理时间较长，温度较高时才发生明显的美拉德反应。美拉德反应的产物使产品呈现褐色，并赋予产品独特的香气[16]。对于几种杀菌工艺效果比较后，结果如表2所示。

表2 原料乳不同杀菌工艺参数效果的比较

一般酸奶制作的杀菌条件是：85℃，30 min或95℃，5 min，由于本试验中干酪乳杆菌采用的是长时间发酵，因而在原料乳杀菌时更应杀灭所有的致病菌以免引起杂菌污染现象。因此原料乳杀菌工艺参数的选择就显得至关重要。从表2中可以看出，凝乳I、II颜色太浅，凝乳V颜色过深，而凝乳III、IV在颜色上较相近且容易被消费者接受。所以选择工艺III作为最后的杀菌工艺，即灭菌条件为115℃，15 min。

2.2 发酵工艺

2.2.1 发酵剂接种量的确定

接种量除能引起酸奶口感上的酸度差异之外，还会影响酸奶的组织状态与风味[17]。利用嗜热链球菌和干酪乳杆菌你的共生关系和嗜热链球菌的产酸特性，在添加2%的嗜热链球菌的基础上，添加2%（体积分数）、3%、4%、5%、6%的干酪乳杆菌。通过测定酸羊乳在发酵结束后和后熟24 h后的酸度、活菌数以及制成乳酸菌饮料后的感官评价得出酸乳的最优工艺条件。对于几种接种量发酵效果比较后，结果如表3所示。

表3 发酵剂不同添加量对产品的影响

由表3可以看出，2%的嗜热链球菌与5%和6%的干酪乳杆菌组合发酵制作的乳酸菌饮料酸度和活菌数最高。发酵前期，嗜热链球菌生长速度较快，能迅速发酵产酸，产生的一些代谢产物能促进干酪乳杆菌的生长繁殖。发酵中后期，在高酸度的基料中，嗜热链球菌的生长繁殖受到抑制，干酪乳杆菌占据发酵的主导地位、繁殖较快。2%的嗜热链球菌与4%、5%和6%的干酪乳杆菌组合发酵制作的羊奶饮料感官评分较高。结合以上分析从而确定最佳发酵剂添加量为：2%的嗜热链球菌与5%的干酪乳杆菌进行组合发酵。

2.2.2 最佳发酵时间的确定

羊奶饮料酸甜可口，深受消费者喜爱，其酸度的来源主要为乳酸菌发酵过程中产生的乳酸，当生产中酸度不足以使产品达到相应的酸度时，通常会使用柠檬酸调节到需要的酸度，但这势必会影响到发酵基料中的活菌数量和乳蛋白的充分降解，也会最终影响到饮料产品的益生功能和保健功效[18]。所以合适的发酵时间是羊奶饮料发酵达到最佳酸度的一个重要影响因素。因此本实验在2%的嗜热链球菌与5%的干酪乳杆菌进行组合发酵时，选取10，15，20，25，30 h五个不同的发酵时间，结果如表4所示。

表4 不同发酵梯度对产品的影响

结果表明，2%的嗜热链球菌与5%的干酪乳杆菌进行组合发酵时，当发酵时间为25 h时，其活菌数、酸度和感官等分最高，所以羊奶饮料的最佳发酵时间是25 h。

2.3 稳定剂的确定

2.3.1 高酯果胶对乳酸菌饮料稳定性的影响

果胶是由D-半乳糖醛酸残基经α-(1,4)糖苷键相连接聚合而形成的酸性大分子多糖，根据酯化度的不同，称为高甲氧基果胶和低甲氧基果胶。果胶在酸性乳饮料中能与酪蛋白所带正电荷发生静电作用，形成亲水性复合物，避免颗粒间的聚合作用，使酪蛋白胶束颗粒得以稳定地分散。高酯果胶作为酸性乳饮料中优良的稳定剂，目前在国内外得到了广泛的研究[19]。

图1 高脂果胶添加量对乳酸菌饮料稳定性和感官品质的影响

从图1中可以看出，随着高脂果胶添加量的增加，产品离心沉淀率出现逐渐下降的趋势，稳定性逐渐增强。产品的感官得分随高脂果胶添加量的增加先上升，当添加量为0.1%时，出现最大值为84。但当高脂果胶的添加量超过一定量时，调配液黏度太大，冷却后有凝胶出现，与发酵乳混合均质后的口感欠佳且过于黏稠。当高脂果胶的添加量为0.125%时，产品的离心沉淀率为3.9%，感官得分大于80，因此选择此添加量为高脂果胶添加量的最佳水平。

2.3.2 蔗糖酯对乳酸菌饮料稳定性的影响

乳饮料中主要的不稳定物质是脂肪和蛋白质。脂肪与水互不相溶，易发生分离而出现分层现象，加入乳化剂后，能够形成具有外亲水结构的固体—乳化剂双层，生成可再溶剂化的粒子，使饮料稳定性增强[20]。

图2 蔗糖酯添加量对乳酸菌饮料稳定性和感官品质的影响

由图2可以看出，随着蔗糖酯添加量的增加，饮料的离心沉淀率大幅度下降，当添加量大0.15%时，下降的程度不明显。产品的感官得分随蔗糖酯添加量的增加先上升，当添加量为0.15%时，出现最大值，后随着添加量的增加而下降。因此选择蔗糖酯最佳添加量水平为0.15%。

2.3.3 CMC对乳酸菌饮料稳定性的影响

羧甲基纤维素钠(CMC)，是一种阴离子多糖。在酸性条件下，它与酪蛋白发生吸附，提供静电排斥和空间位阻作用，同时CMC可使体系黏度增加，起到稳定作用[21]。因而被广泛应用到乳酸饮料中。

图3 CMC添加量对乳酸菌饮料稳定性和感官品质的影响

产品的离心沉淀率随着CMC添加量的增加先出现大幅度下降，当添加量大0.15%时，下降的程度不明显。产品的感官得分随CMC添加量的增加先上升，当添加量为0.15%时，出现最大值，0.15%之后随着添加量的增加而下降。当CMC添加量0.15%时，离心沉淀率为3.9%，感官得分为82。此时产品口感适中，无黏稠感，风味纯正，离心后沉淀量少。因此选择CMC最佳添加量水平为0.15%。

2.3.4 正交试验结果与分析

根据单因素试验结果，以高脂果胶、蔗糖酯、CMC最佳添加量分别作为正交试验设计的1、2和3水平。在此基础上设计L9（33）正交优化实验，以产品的沉淀率和感官得分为评价指标，通过极差和方差分析获得最佳工艺条件。

表5 正交实验因素水平

表6 正交实验结果与极差分析

正交实验的因素水平如表5所示。实验结果及极差分析如表6所示。由表6可以看出，在提高产品的稳定性方面，稳定剂的最佳配比为A1B2C2，即高脂果胶的添加量为0.0125%，蔗糖酯的添加量为0.03%，CMC的添加量0.03%。采用直观分析法比较3个因素的R值可知，各稳定剂的添加量对饮料稳定性的影响程度由大到小的顺序为高脂果胶＞CMC＞蔗糖酯。采用直观分析方法，比较3个因素的R值可以看出：各稳定剂的添加量对感官品质的影响程度为高脂果胶影响程度最大，其次是CMC和蔗糖酯，且两者的R值相差不大。

由上述分析可知，在获得产品的最佳稳定效果和感官品质方面，正交优化试验得到的最佳配比均为A1B2C2，即高脂果胶的添加量为0.0125%，蔗糖酯的添加量为0.03%，CMC的添加量0.03%。

2.3 验证实验

在115℃（15 min）下对复原羊奶进行杀菌后，添加5%的干酪乳杆菌和2%的嗜热链球菌进行组合发酵，最佳的发酵时间为25 h。在复合稳定剂最优配比的条件下(高脂果胶、蔗糖酯、CMC的添加量分别为0.0125%，0.03%，0.03%)所制备的干酪乳杆菌羊奶饮料褐色适中、有浓郁的发酵乳香气和美拉德反应风味，感官得分为89。最终测得产品离心沉淀率为2.38%，活菌数高达4.7×108mL-1，生产周期缩短为24 h左右。

3 结论

针对干酪乳杆菌单独发酵乳饮料发酵周期过长，前期易染杂菌的问题进行了改进，利用嗜热链球菌与干酪乳杆菌的共生作用，研制出了一款活性干酪乳杆菌羊奶饮料。

从凝乳颜色、口感指标等方面综合考虑，本实验最终确定最佳杀菌条件为115℃，15 min；从活菌数、感官得分方面，最佳发酵剂接种量为在2%嗜热链球菌的基础上添加5%的干酪乳杆菌，最佳的发酵时间为25h。通过单因素试验和正交优化试验得到了干酪乳杆菌羊奶饮料稳定剂的最佳复配比为：高脂果胶的添加量为0.0125%，蔗糖酯的添加量为0.03%，CMC的添加量0.03%。验证实验得到的产品褐色适中，有浓郁的发酵乳香味，感官得分为89。最终测得产品离心沉淀率为2.38%，活菌数高达4.7×108mL-1。