生鲜乳中黄曲霉毒素M1的不确定度测定

何立宁，赵兴鑫，吕洁，赵义良，魏昆鹏，宋瑞

（石家庄市农业畜牧局，石家庄 050000）

0 引 言

生鲜乳中的黄曲霉毒素产生主要原因是由于奶牛采食了被黄曲霉和寄生曲霉的代谢物污染的饲料后，在奶牛体内代谢产氢的羟基化代谢物。欧盟规定，黄曲霉毒素M 1（简称AF M 1）在婴幼儿配方奶粉和婴儿特殊医用食品中的限量值为0.025μg/kg，在牛奶中的限量值为0.050μg/kg[1]，在我国食品安全国家标准食品中真菌毒素限量（GB 2761-2017）中规定AF M 1在乳及乳制品、婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、辅食营养补充品、运动营养食品和孕妇及乳母营养补充食品中的限量均为0.5μg/kg[2]，由此可见准确测定AF M 1的含量尤为重要。

测量不确定度的定义为：表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数[3]。本文将参考JJF1059-2012《测量不确定度评定与表示》的相关要求，采用GB 5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》第一法开展测量不确定度的评定，以便得到更加准确和可靠的检测数据。

1 实 验

1.1 仪器与试剂：

ME203E电子天平，AB Sciex Triple Quad 5500液质联用仪，Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，粒径1.8μm），酶联免疫亲和柱（1 mL），AF M 1标准品（10.1μg/mL,99%），13C17-AF M 1（0.504μg/mL，98.3%）。

1.2 方法

参照GB 5009.24-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M族的测定》第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法进行。

1.3 质谱参数

电离源：ESI（+）；检测方式：多离子反应监测（MRM）；离子化电压：5 500 V；气帘气173 k Pa；温度：550℃；喷雾气：380 kPa；辅助加热气：380 kPa；碰撞气：55 kPa。

1.4 液相色谱条件

流动相A为浓度5 mmol/L乙酸铵水溶液；流动相B为甲醇-乙腈（1∶1）；流速为0.3 mL/min；进样体积为10μL；梯度洗脱如表2所示。

2 结果与分析

2.1 测量结果不确定度的数学模型

试样中AF M 1的残留量为

表2 流动相洗脱梯度表

式中：X为AF M 1的量；ρ为上机液中AF M 1按照内标法在标准曲线中对应的质量浓度；V为最终定容体积；f为稀释因子；m为试样称样量。

2.2 不确定度来源分析

通过对整个实验过程和数学模型的分析，生鲜乳中AF M 1测定的不确定度因素及其影响来源如下：

（1）上机液中AF M 1按照内标法在标准曲线中对应的质量浓度c引入的不确定度；（2）最终定容体积V引入的不确定度；（3）试样称样量m引入的不确定度；（4）样品中加入内标引入的不确定度；（5）检测仪器引入的不确定度。

3 标准不确定度分量的评定

3.1 AF M 1的质量浓度引入的不确定度

3.1.1 由标准品浓度引入的不确定度

通过AF M 1标准物质证书可知，标准品浓度的准确度为标识浓度的±0.42μg/mL，属于正态分布，包含因子k=2，标准品浓度为10.1μg/mL，则其相对标准不确定度为

3.1.2 由内标浓度引起的不确定度

通过AF M 1的内标物证书可知，内标物浓度的准确度为标识质量浓度的±0.008μg/mL,属于正态分布，包含因子k=2，内标物质量浓度为0.504μg/mL，则其相对标准不确定度为

3.1.3 引入的标准不确定度

标准储备液及内标物稀释过程中引入的不确定度主要来自移取标液和定容时引入的不确定度。用1 mL的移液器移取质量浓度为10μg/mL的标准品1 mL，定容至100 mL，得到质量浓度为100 ng/mL的工作液和用1 mL的移液器移取质量浓度为0.5μg/mL的标准品1 mL，定容至10 mL，得到50 ng/mL的内标物工作液。

100 mLA级容量瓶的容量允许差为±0.1 mL[5]，不考虑温度对其膨胀系数的影响，按均匀分布考虑，k=，可计算出100 mLA级容量瓶定容引入的标准不确定度为：

10 mL A级容量瓶的容量允许差为±0.02 mL，不考虑温度对其膨胀系数的影响，按均匀分布考虑，k=，可计算出10 mL A级容量瓶定容引入的标准不确定度为：

1 mL移液器经检定后的容量相对误差为-0.6%，则该移液器的最大误差为0.006 mL，按均匀分布考虑，可计算出该1 mL移液器引入的标准不确定度为：

标准储备液和内标物稀释过程中引入的标准不确定度Ud为

3.1.4 量器校准引入的标准不确定度

分别准确移取质量浓度为100 ng/mL的工作液5，10，50，100，200，500μL至10 mL容量瓶中，加入100μL质量浓度50 ng/mL内标工作液，用初始流动相定容至刻度，得到质量浓度为 0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 ng/mL的系列标准溶液。该过程的标准不确定度主要是通过移液和定容过程引入的（见表3）。

表3 不同移液器引入的不确定度计算结果

已知10 mL A级容量瓶定容引入的标准不确定度为：0.00115，则标准工作曲线配制过程中量器校准引入的标准不确定度UVc为

3.1.5 添加过程中引入的不确定度

配置质量浓度为50 ng/mL的同位素内标工作液：取AF M 1同位素内标（0.5μg/mL）1 mL，用乙腈稀释至10 mL。用量成为100～1 000μL的移液器准确移取，查该移液器检定证书，其1 000μL的容量相对误差为-0.6%，其不确定度为6μL,标准不确定度为0.006。10 mL的A级容量瓶定容引入的标准不确定度为0.00115。

在标准系列工作液中加入100μL质量浓度为50 ng/mL的同位素内标工作液。100μL移液器的标准不确定度为0.0058。

则标准工作曲线中内标物配置和添加过程中引入的不确定度UVis为：

3.1.6 标准曲线拟合产生的不确定度

测定质量浓度为0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0 ng/mL标准溶液，测得其峰面积结果如表4所示。

表4 标准溶液浓度-峰面积结果

以峰面积和浓度作标准曲线，采用最小二乘法进行线性拟合，得到标准曲线方程为A=133942c-6732.8，R2=0.999，其中斜率为133942，截距为-6732.8，对样品进行二次测量，有标准曲线求得样品中AF M 1的质量浓度为1.730 ng/mL。

取样液连续上机测试8次，结果如表5所示。

表5 取样液连续上机测试8次的仪器测量结果

表5可以看出，极差R=11949，属于A类评定，由于测量次数较少，依据相关标准采用极差法进行评定，其中n=8，C=2.85，故样液峰面积测量引入的相对标准不确定度UA为

样液中AF M 1的浓度引入的标准不确定度Uc为

3.2 最终定容体积V引入的不确定度

样品经提取、净化后，收集全部洗脱液，在50℃氮气下缓慢吹至尽干，用初始流动相定容至1.0 mL。已知1 mL移液器的标准不确定度为0.006。

3.3 试样称样量m引入的不确定度

根据标准要求，准确称取4 g混合均匀的样品，查电子天平检定证书，在量程为0～50 g时，最大允许误差为±0.5 mg，按均匀分布进行计算，则；天平检定结果误差为0.2 mg，则；计算称样过程中所引入的标准不确定度；由于Um远小于其他几个分量的不确定度，故舍去。

3.4 样品中加入内标引入的不确定度

在样品中加入100μL质量浓度为5 ng/mL的AF M 1同位素内标工作液。100μL移液器的标准不确定度为0.0058。

质量浓度为5 ng/mL的AF M 1同位素内标工作液的配置：取AF M 1同位素内标（质量浓度0.5μg/mL）100μL，用乙腈稀释至10 mL。引入的不确定度包括100μL移液器和10 mL容量瓶，标准不确定度分别为0.0058和0.00115。

则样品中加入内标引入的不确定度UI为0.0083。

3.5 串联质谱仪引入的不确定度

仪器检定结果中，相对扩展不确定度为3%，k=2，则相对标准不确定度为UMS=0.03/2=0.015。

4 合成标准不确定度

以上各不确定度分量互不相关，则生鲜乳中AF M 1检测结果的相对不确定度为

5 扩展不确定度的计算

本研究中测定样品中的AF M 1质量分数为0.406 μg/kg，可以计算出合成标准不确定度，即Ux=0.406 μg/kg×0.0996=0.040μg/kg；取k=2,此样品中AF M 1质量分数的扩展不确定度为U=2Ux=0.08μg/kg。

6 结果

样品中AF M 1质量分数测定结果用测量不确定度的形式可表示为（0.406±0.08）μg/kg，取包含因子k=2。