葡萄籽中原花青素抗肺癌作用机制研究进展
2018-10-21韩何丹王海高丽萍
韩何丹 王海 高丽萍
[摘要]葡萄籽原花青素是由儿茶素和表儿茶素组成的低聚或高聚多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎、清除自由基、抗肿瘤等多种生物学活性,因此,对于葡萄籽原花青素在诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、调控信号分子等方面抗肺癌作用机制的研究进展进行了综述。
[关键词]葡萄籽原花青素;肺癌;细胞凋亡;细胞周期
[中图分类号]Q 946836[文献标志码]A[文章编号]10050310(2018)01005005
Research Progress on Antilung Cancer Mechanism of
Grape Seed Proanthocyanidins
Han Hedan, Wang Hai, Gao Liping
(College of Biochemical Engineering, Beijing Union University, Beijing 100023,China)
Abstract: Grape seed proanthocyanidins is oligomeric or polymeric polyphenolic compounds, consisting of catechin and epicatechin with antioxidant, scavenging free radicals, antiinflammatory, antitumor and other biological activities. This paper summarized the research progress on antilung cancer mechanism of grape seed proanthocyanidins aboutproapoptotic effect, cell cycle arrest, progress in regulation of signaling molecules.
Keywords: Grape seed proanthocyanidins; Lung cancer; Apoptosis; Cell cycle
近年来,肿瘤的发病率逐年增高,尤其是肺癌,在恶性肿瘤中已居首位。尽管在过去的几十年间,医疗取得了较大的进步,但在我国,肺癌的5年存活率仍不足15%,在其他国家也是首位的癌症致死原因。因此,人们迫切需要找到新的肿瘤治疗手段。目前大约有2 000多种天然与合成的化学物质在特定的临床前研究中表现出化学预防和治疗作用。原花青素是一大类可从植物中提取的、有多种生物活性功能的多酚化合物[1]。其中以葡萄籽中含量最高,葡萄籽中原花青素的提取量可达205%[23]。研究发现,葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins, GSP)抗肺癌的效果良好。
1GSP简介
11葡萄籽原花青素的成分和结构
葡萄籽原花青素的成分主要是黄烷醇及其低聚物等黄酮类化合物,由以下4种基本结构组成:(+)—儿茶素、(-)—表儿茶素、(-)—表儿茶素没食子酸以及没食子酸酯。GSP中这4种结构的单体形式只占100%左右,此外,主要通过C4C6或C4C8连接形成二、三、四聚体的形式出现,最高聚合度为15。根据聚合度的不同,葡萄籽原花青素又分为高聚葡萄籽原花青素(polymeric grape seed proathocyanidins, PGSP)和低聚葡萄籽原花青素(oligomeric grape seed proathocyanidins, OGSP)。其中生物活性最强的是OGSP[46]。
12GSP的生物学活性
经过大量的研究证实,GSP具有极强的清除自由基和抗氧化活性、抗疲劳、抗辐射损伤、延缓衰老、心血管保护作用及抗高血糖、抗肿瘤、抗诱变等作用[7]。它是目前公认的抗氧化能力最强的天然抗氧化剂之一。在同等条件下,GSP的氧自由基清除能力是维生素C (VC)的5~6倍。通过建立生物膜模型检测OGSP和维生素E (VE)的抗氧化能力时,发现原花青素较VE能有效延长羟基自由基诱导的卵磷脂脂质体过氧化作用,而当GSP和VE联合使用时,发现二者具有明显的协同作用,可以大大加强抗氧化作用。原花青素的清除自由基和抗氧化能力是目前被应用得最多的方面,其作用主要表现在:1)有效地清除超氧阴离子自由基和羟基自由基等,也可中断自由基链式反应;2)参与磷脂、花生四烯酸的新陈代谢和蛋白质磷酸化,保护脂质不发生过氧化损伤;3)为强有力的金属螯合剂,可螯合金属离子,在体内形成惰性化合物;4)保护和稳定维生素C(VC),并有助于VC的吸收。
13葡萄籽原花青素的生物利用度
从葡萄籽中提取的原花青素属于生物类黄酮,其水溶性好,有效性高,其中低聚原花青素的生物利用度在90%以上,极易被人体吸收[6]。有研究通过给小鼠灌胃和大鼠腹腔注射14C标记的原花青素,发现原花青素在胃肠道中吸收速度快,在45 min时达到吸收的最高峰,半衰期为5 h,有14%的原花青素在11 h内经过胆汁排出体外[8]。
北京联合大学学报2018年1月
第32卷第1期韩何丹等:葡萄籽中原花青素抗肺癌作用机制研究进展
14葡萄籽原花青素的安全性
毒理研究报道,给大鼠和小鼠口服葡萄籽原花青素,测得的半数致死剂量(LD50)均在4 000 mg/kg以上。Yamakoshi等研究报道多聚体葡萄籽原花青素在急性毒性剂量(2 g/kg、4 g/kg)和90天慢性毒性剂量(002%、02%、2%)下未见不良反应,无可见有害作用水平(No Observed Adverse Effect Level, NOAEL)为2%,相当于男性1 410 mg/(kg·d),女性1 501 mg/(kg·d)[9]。微核实验[2 000 mg/(kg·d)]、Ames实验(5 000 μg/平板)结果显示,葡萄籽原花青素無致畸和致突变作用[10]。
2葡萄籽原花青素抗肺癌作用机制
21促进肺癌细胞凋亡
细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主、有序的死亡。近年来学者提出,由外界刺激造成DNA损伤而诱发的细胞凋亡分子机制主要包括3条途径,即线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径,且各途径之间是紧密联系和相互作用的[11]。细胞凋亡途径在抗肿瘤药物研究过程中发挥着重要的作用,因为细胞凋亡是大多数抗肿瘤药物发挥抗肿瘤效应机制之一。
张国瑜等以不同浓度的葡萄籽原花青素与人肺腺癌A549细胞在体外共同培养,结果表明原花青素在25~250 μg/mL范围内可呈时间和剂量依赖性地抑制A549细胞的增殖[12]。Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态学表现为染色质凝集、细胞核破裂成碎片等细胞凋亡特征性变化。通过TUNEL法检测细胞凋亡,发现0、25、25、250 μmol/L浓度原花青素组的细胞凋亡率分别为625%、1674%、1847%、2414%。另外,张国瑜等还发现25 mg/L和250 mg/L
质量浓度的原花青素作用A549细胞24 h,琼脂糖凝胶电泳可见凋亡细胞典型的梯状DNA条带,Caspase9、Caspase3蛋白表达量与花青素浓度成正相关,Bcl-2蛋白表达量与花青素浓度则成负相关,结果表明原花青素可通过线粒途径诱导细胞凋亡[13]。
高爱霞等将人大细胞肺癌细胞NCIH460在含不同浓度原花青素的培养液中培养24 h、48 h、72 h,结果表明,花青素对细胞增殖有显著抑制作用,呈剂量—时间依赖性。DNA琼脂糖凝胶电泳在50、100、200 μg/mL花青素组能检测到明显降解的梯形条带,对照组和25 μg/mL组没有凋亡条带[14]。另外,高爱霞在Hoechst33258荧光染色实验中发现正常组和25 μg/mL花青素组细胞核为均匀蓝色,50、100、200 μg/mL花青素组染色致密发亮且有部分细胞核断裂成碎片的凋亡细胞。流式细胞术检测25、50、100、200 μg/mL花青素对NCIH460细胞的凋亡率分别为13%、20%、117%和278%,明显高于对照组[15]。
22阻滞肺癌细胞周期
细胞周期在细胞增殖与凋亡中起着重要的作用。细胞周期可分为G0/G1、S、G2/M三个阶段,其中G1期与G2期进行RNA的复制与有关蛋白质的合成,S期进行DNA的复制,因此
,S期是完成遗传信息复制的最重要的阶段。阻滞细胞周期由G1期到S期的过渡是抑制肿瘤细胞增殖的有效方法和治愈癌症的重要前提条件。
参与细胞周期调控的因子有:细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase, CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclindependent kinase inhibitor, CKI)、视网膜神经胶质瘤蛋白(Rb)。CKI为新发现的一类蛋白,通过与CDK、Cyclin或CyclinCDK复合物的结合,抑制CDK的激酶活性,从而调节细胞周期正常有序地进行。视网膜神经胶质瘤蛋白Rb是一种抑癌基因表达的蛋白,可以通过调控细胞周期G1期的检验点来调节细胞增殖,Rb蛋白的活性由其磷酸化水平来调控。
根据王海等的研究报道,5 mg/L的顺铂(DDP)可以引起A549细胞S期阻滞,4 mg/L的OGSP能够引起A549细胞G0/G1期阻滞,两者联用既能形成G0/G1期阻滞,又能形成S期阻滞。OGSP单独处理可以显著降低Cyclin D1和CDK4蛋白水平,并能够显著降低DDP引起的pRb蛋白水平的升高[16]。张小芳在GSP对肺腺癌SPCA-1細胞X射线放疗的增敏作用的研究中发现,GSP对肺癌SPCA-1细胞有较好的放疗增敏作用,增敏剂量在50~100 μg/mL之间,GSP能使G0/G1期细胞比例明显增加,S期和G2/M期减少,促进细胞的凋亡[17]。
23调控信号分子
231VEGF
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)又称血管通透因子(vascular permeability factor, VPF),是胎儿和成人血管生成和血管生长过程中重要的调控因子。VEGF是特异性作用于内皮细胞的糖基化细胞有丝分裂素,在增强血管的渗透性、诱导血管生成和血管生长及内皮细胞生长、促进细胞迁移、抑制细胞凋亡等方面发挥作用。癌细胞的生长、转移依赖新生血管的形成,VEGF是最有效的促血管生长因子。以VEGF及其受体VEGFR为靶点治疗癌症是药物研究的热点。
陈聂等在探讨GSP对大鼠肺纤维化的治疗作用的研究中发现,用博莱霉素诱导大鼠实验性肺纤维化后,大鼠肺组织VEGF和VEGFR1蛋白及mRNA含量均明显高于正常对照组,而GSP组中VEGF和VEGFR1蛋白及mRNA含量均明显低于模型组,且给予GSP 7天和14天,VEGFR1和mRNA的表达依然低于模型组[18]。因此,GSP可有效抑制VEGF和VEGFR1的表达来抑制肺组织病理性血管生成,从而起到抗肺纤维化的作用。
232EGFR
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白,是原癌基因cerbB-1的表达产物,EGFR 及其配体是细胞信号传导系统的一部分。研究表明,EGFR基因拷贝数增加或者过度表达,均能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移。Castanon等和Sette等发现在健康人肺组织中EGFR呈现低表达或不表达状态,而在超过60%以上肺癌患者中存在过表达[1920]。因此,EGFR的信号传导网络在肿瘤的形成和发展过程中起重要作用。
EGFR的信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环,与肿瘤的形成和恶化息息相关。周也涵等研究GSP对肺癌A549细胞的侵袭和迁移的实验结果表明,GSP以剂量依赖的方式抑制A549细胞的增殖,并显著降低EGFR的蛋白表达,导致细胞迁移和迁移能力明显下降[21]。
233GST-π
谷胱甘肽硫转移酶(glutathione stransferase,GST)是广泛分布于各种生物体内的一组多功能同工酶[22],是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一,是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。其主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原性谷胱甘肽的巯基偶联,增加其疏水性,使其易于穿越细胞膜,并在被分解后排出体外,从而达到解毒的目的[2325]。依GST同工酶亚基结构和等电点的不同,将GST分为α、θ、μ、π和σ五种[26],π类谷胱甘肽S转移酶(GSTπ)的作用大于其他同工酶类,与人类肿瘤关系密切[2728]。近年来的实验研究表明,GSTπ在肿瘤细胞恶性生物学行为出现之前就可表现出表达的异常升高,形成酶变灶或酶变细胞,参与肿瘤的迁延、转移等恶性生物学行为。涂静以非小细胞肺癌细胞NSCLC为研究对象,发现花青素可以减少NSCLC细胞GSTπ的mRNA含量和蛋白表达,可降低由GSTπ高表达带来迁延转移多药耐药等生物学行为,有助于肺癌的临床化疗[29]。
234COX2
环氧合酶(COX)是前列腺素(PGs)合成所必须的酶。目前发现细胞中至少有两种COX的编码基因,即COX1和COX2两种亚型。COX1和COX2具有61%的同源性,但卻表现出明显的功能差异。COX2主要分布在细胞膜上,其表达调控主要集中在转录水平,COX2与炎症和肿瘤的发生关系密切。在生理状态下,COX2在大多数组织中不表达或微表达,但在正常组织癌变以及癌细胞增殖过程中均会过量表达,故该基因的表达可能与肿瘤的发生和恶化有关[3031]。动物实验发现[32],COX2的表达会增加前列腺素E2(PGE2)的合成,PGE2可诱导细胞增殖并刺激BcL2蛋白表达,而后者抑制细胞凋亡,从而促进肿瘤的发展。
卢婷婷和梁统以白介素1β(IL1β)诱导的人肺癌细胞A549为模型,研究原花青素对环氧合酶2(COX2)启动子活性的影响[33]。此试验中用含完整的和NFκB结合位点突变的COX2启动子的荧光素酶表达载体pGL3质粒转染 A549细胞。实验组加原花青素(20 μg/mL)培养,对照组加01% DMSO。结果显示,未加原花青素的含完整COX2启动子的A549细胞 COX2启动子活性经IL1β诱导后活性明显增高,而NFκB结合位点突变的COX2启动子活性很低,且经IL1β诱导后活性无明显变化。20 μg/mL原花青素作用下IL1β诱导产生的完整COX2活性较未经原花青素组有显著降低,即原花青素对COX2的启动子活性有明显的抑制作用。
3结束语
肺癌作为人类发病率最高的癌症,严重威胁着人类的生命健康,人们不仅需要积极探索研发更有效的治疗方法,也应该重视对肺癌的预防和早期诊断,降低肺癌的发病率,有效地降低肺癌对人类的危害。国内外大量的研究结果对葡萄籽原花青素的抗肿瘤作用都作出了肯定,且相对于现在常用的治疗方式,葡萄籽原花青素对人体正常细胞并无毒副作用,这就为原花青素在肺癌的预防和治疗中的应用打下了基础。但是目前对原花青素的研究还仅局限于体外实验或动物实验,对其在人体上的抗肺癌作用还少见相关研究报道,所以对葡萄籽原花青素在人体的抗肺癌应用还需要进一步研究。就目前关于葡萄籽原花青素的研究成果而言,它将是很有潜力的抗肺癌药物。[参考文献]
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(责任编辑李亚青)