提高羔羊超排效果的技术措施

佟桂芝 海龙 李信涛 董正德 王伟霞 宋斌 李玉龙 郭立宏 王嘉厚

摘要：羔羊卵母细胞作为体外胚胎生产的试验材料，越来越多地得到国内外研究人员的广泛关注。为了利用羔羊超数排卵的卵子扩展体外受精所需卵子的来源、缩短世代间隔、产生大量优秀后代、加速育种进程，国内外学者纷纷进行了羔羊超排后进行活体采卵及体外受精、胚胎移植实验，目前已经取得了一定的成果。但总体效率还不是很高，利用羔羊作为供体来生产胚胎时，常出现个体对激素诱导无任何反应现象。本文对生殖激素的使用、羔羊超排反应、卵母细胞发育效率、卵母细胞的基因表达、卵母细胞及受精卵培养体系的优化等影响因素进行总结与分析，提出羔羊超排存在的问题并展望其发展前景，为这一技术能在更多家畜繁殖领域的商业化生产提供参考资料。

关键词：羔羊;超数排卵;腹腔镜采卵

中图分类号：S826.3 文献标识码：B 文章编号：2095-9737（2018）10-0047-02

我国开展羔羊超排研究是从2005年着手开展引进，首先应用于肉羊繁殖育种上，2006年该技术应用于奶牛优良品种繁育上。该项技术的应用加快了良种的快速繁育，对推动我国养殖业的快速发展具有重要意义。目前应用羔羊卵母细胞进行胚胎生产的效率低下，仍然需要进一步研究。同时，羔羊卵泡发育效果受许多因素的影响，如羔羊品种、激素处理方法、采卵方法等。为提高羔羊体外胚胎生产效率，加大良种羊的扩繁速度和缩短育种世代间隔，现从羔羊超排方法、卵子不同采集方法、超排月龄、品种等因素对超排后卵母细胞数量的影响进行分析，为提高绵羊体外胚胎生产效率提供一定的理论依据。

1 羔羊月龄对超排羔羊卵泡发育和卵母细胞采集情况的影响

羔羊超排时月龄是影响超排效果的关键因素之一，超数排卵的目的是能实现卵母细胞的最大获取量。Earl.CR等报道[1]，母羊在妊娠期的135天开始，胎儿卵巢上才开始出现有腔卵泡，出生时数量明显增加。卵泡发育在羔羊出生后4～8周龄时达到高峰，但随着青春期的到来开始减少。羔羊在1月龄时进行外源激素诱导后，卵巢上具有繁育过程中最多数目的卵泡发育。而后随着年龄的增长，卵巢上发育的卵泡数有所下降，到初情期后保持相对稳定。于勇等[2]对1、3月龄羔羊进行外源激素FSH+PMSG处理，发现两者卵巢上发育的卵泡数存在显著差异，3月龄羔羊卵巢上发育的卵泡数仅为其1/4左右，显著低于1月龄羔羊的卵泡数。不同月龄羔羊在相同激素处理下卵巢及子宫的发育情况FSH+PMSG处理后卵巢、子宫1月龄羔羊较3月龄羔羊变化明显的结果相似。幼龄动物进行激素处理时，年龄是个重要的影响因素。

赵金红（2015研究发现，4～8周龄羔羊组卵巢超排反应、回收卵母细胞数、可用卵母细胞数与8～12周龄、12～16周龄组差异显著（P<0.05）。4～8周龄酉州乌羊幼羔在激素处理后卵巢长度和宽度明显高于1216周龄组。Morton等[4]研究结果表明，羔羊出生后早期，繁殖器官生长明显，4、8周龄时卵巢重量比出生时分别增加6.8倍和10.8倍，8～12周龄时卵巢增重开始下降，直至33周龄时保持恒定。Ptak等[5]研究表明，1月龄羔羊超排效果最好，3月龄最差。

2 羔羊出生重及超排时体重

影响超排效果的动物因素主要包括个体和遗传的差异等。代相鹏等[6]的研究结果表明，体重和超排季节对供体超排效果没有显著影响。刘太宇等[7]的研究结果表明，授精方式等因素对超排效果没有显著影响。秦雪等[8]对6～8周龄的健康杜晋绵羊进行超数排卵，结果表明：初生重与卵母细胞数量呈极显著正相关（P<0.01），超排时体重与卵母细胞数量相关不显著（P>0.05）。超排时体重不是影响羔羊超排效果的主要因素。但是在实际生产中，应选择初生重大及超排时体重良好的羔羊进行超数排卵，这些羊的体况及营养状况都能够达到更好的水平，有助于提高羊群的质量。

3 超排激素及超排方案对羔羊超排效果的影响

常规幼畜的超排方法主要是利用促性腺激素FSH（PMSG）和LH诱导其卵巢卵母细胞发育。目前羔羊超排方法一种是孕酮+促性腺激素法，另一种是促性腺激素法;主要有GnRH、FSH+LH法，获得的卵母细胞数存在差别。Morton K M等[4]对30～40日龄的羔羊进行激素超排，每只羔羊平均得到86.2±7.9枚卵母细胞。Ptakt[5]等给1月龄的羔羊放置孕酮栓8天，第8天撤栓，第5～7天每天注射FSH2次，获得平均每只羔羊29枚卵母细胞。胡鹏飞[9]对2月龄的杂种羊利用促性腺激素超排后平均获得15.。枚卵母细胞。鲁彦（2011）[10]采用两种超排方案对新疆细毛羊羔羊进行超排：结果加拿大激素和宁波激素超排效果两者采用等量法超排的卵母细胞数差异不显著;加拿大激素减量法超排效果较差，宁波FSH超排卵数从20～230枚。Gou等数82枚。谷振慧[12]采用加拿大激素超排处理102只4～8周龄的羔羊，平均获卵数79枚。秦雪（2014）[8]用FSH+PMSG方案获得发育卵泡数显著高于FSH+LH方案。FSH在体内的半衰期短，需要多次注射;PMSG单独使用会导致未排卵的卵泡数量增加。陈童等[13]对4～9周龄的超細型澳洲美利奴。间隔12h连续进行6次FSH肌肉注射，FSH总剂量为120mg。其中一组在第5次注射FSH的同时，肌肉注射 PMSG 400万IU，另外一组不注射PMSG。试验在超排效果上不断优化，使用国产激素达到了比较稳定而且较好的效果;卵母细胞回收率也在熟练中不断提高。克服制约羔羊超排产业化应用的主要障碍。不断完善幼畜超排方法、程序，以提高体外胚胎生产效率及探索适宜的超排方法来稳定超排效果。幼畜卵泡库对于育种和科研等方面的意义和潜力绝对是不容忽视的。

4 采卵方法

手术采卵法：剖腹手术将卵巢和子宫引出体外，随后抽吸卵泡液。与内窥镜法相比，本法对羔羊的损伤较大，术后易发生黏连，但可以直观的观测卵泡的发育，卵回收率高。将供体羔羊保定好，肌注0.1mL左右静松灵进行麻醉，纵向切一个3cm切口，从切口将卵巢拉出，用10mL注射器（提前吸有2mL抽卵液）抽吸卵巢上2～8mm卵泡液，抽卵结束时，将抽卵液转移入50mL离心管，37℃水浴锅中沉淀10～20min，在实体显微镜下选择形态正常的卵子。采卵完毕，再往腹腔中倒人200mL预先温35℃的生理盐水。给羔羊注射0.1mL左右苏醒灵。

腹腔镜采卵法：借助腹腔镜观察卵巢状态，然后利用操作杆和采卵针的配合将卵泡中的卵母细胞采集出来，具有手术切口小、对羔羊应激小、可重复性高等优点。但内窥镜等设备价格昂贵。该法对羔羊伤害较小，羔羊可以重复超排，对成年后的生育能力并不受影响。

摘出卵巢取卵法：将羔羊卵巢摘取后带回实验室，用抽吸或切割的方法获得卵母细胞。这种方法卵母细胞效率较高，减少了活体采卵时凝血的发生，但摘取卵巢后影响了母羊的使用价值。

供体羔羊每次超排处理所获卵母细胞数量会随重复超排次数的增加而逐渐减少，间隔3周重复超排，幼羔的获卵数较初次超排降低。Morton K M等[4]认为卵巢对激素的反应性降低是导致重复超排所获卵母细胞数量下降的主要原因。

参考文献：

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[2]于勇，钟旭，王芬露，等.不同月龄绵羔羊卵泡发育的比较研究[J].中国畜牧杂志，2012，48（9）：17-21.

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[13]陈童，郝耿，杨会国，等.细毛羊羔羊超数排卵及体外胚胎生产移植[J].新疆农业科学2012，49（5）：940-944.