睿臻对肺癌的抑制作用及其机制

黄璐璐 杜倩倩 闫辰 刘春霞 李芋润 高林 李燕 赵青

摘要 目的：初步探讨由山楂、沙棘和枸杞三味中药为主，并添加虫草素、虫草多糖、β-葡聚糖和番茄红素等制备而成的天然药物组方睿臻的体内外抗肺癌活性及其机制。方法：采用MTT法检测睿臻体外抗肿瘤活性，小鼠Lewis移植瘤模型观察单独使用睿臻及联合紫素的抗肺癌活性及对荷瘤小鼠生存时间的影响。FCM实验检测其对肿瘤细胞凋亡的影响，重组基质膜侵袭实验观察对肿瘤细胞侵袭能力的影响，Westernblot方法初步探讨该化合物的作用机制。结果：睿臻对肺癌细胞具有较好的增殖抑制活性，其作用于A549细胞株、NCI-H460细胞株和NCI-H1975细胞株120h后的IC50值分别为98.42μg/mL、60.02μg/mL和60.41μg/mL；睿臻也可显著抑制小鼠Lewis肺癌的生长，9.0g/kg睿臻对小鼠Lewis肺癌的生长抑制率达70.0%，且可在增强紫素的抗肿瘤活性的同时升高胸腺指数及外周血中红细胞数量和血红蛋白水平。睿臻可延长Lewis肺癌小鼠的生存时间。睿臻可诱导肺癌细胞A549和NCI-H460发生凋亡。在96.0μg/mL和192.0μg/mL劑量下，可显著抑制肺癌细胞穿过重组基底膜的数量。Westernblot结果显示睿臻可抑制Raf/MEK/ERK、FAK/p38等信号通路。结论：睿臻在体内外均具有一定的抗肺癌活性，其作用机制可能与阻断Raf/MEK/ERK信号转导通路有关，有望开发成为肺癌治疗的天然药物制剂。

关键词 睿臻；肺癌；增殖；凋亡；侵袭；增效减毒；Raf/MEK/ERK；FAK/p38

AbstractObjective：Toinvestigatetheanti-tumoreffectandmechanismsofRuiZhenwhichcontainshawthorn，hippophae，medlar，cordycepin，cordycepspolysaccharide，β-glucanandlycopeneon.Methods：MTTassaywasusedtoanalyzeanti-proliferationactivityofRuiZheninvitro.Anti-tumoractivityandtheeffectofsurvivaltimewereobservedbymouseLewisxenograftmodelinvivo.TheeffectofRuiZhenonapoptosiswasmeasuredbyFCManalysis.WesternblotwasperformedtoinvestigatetheexpressionlevelofproteinsintumortissuestreatedwithRuiZhen.Results：RuiZhenhasagoodproliferationinhibitoryactivityonlungcancercells.TheIC50valuesofA549cellline，NCI-H460celllineandNCI-H1975celllineafter120hwere98.42μg/mL，60.02μg/mLand60.41μg/mLrespectively.RuiZhencanalsosignificantlyinhibitthegrowthofLewislungcancerinmice，andthegrowthinhibitionrateof9.0g/kgrutheniumonLewislungcancerinmicewas70.0%，anditcanenhancethepurplepigment.Theanti-tumoractivityincreasedboththethymusindexandthenumberofredbloodcellsandhemoglobinintheperipheralblood.RuiZhencanprolongthesurvivaltimeofLewislungcancermice.RuiZhencaninduceapoptosisoflungcancercellsA549andNCI-H460.At96.0μg/mLand192.0μg/mL，thenumberoflungcancercellspassingthroughthereconstitutedbasementmembranewassignificantlyinhibited.WesternblotresultsshowedthatrutheniumcaninhibitRaf/MEK/ERK，FAK/p38andothersignalingpathways.Conclusion：RuiZhenhascertainanti-lungcanceractivityinvitroandinvivo，anditsmechanismmayberelatedtoblockingRaf/MEK/ERKsignaltransductionpathway.Itisexpectedtodevelopintoanaturalpharmaceuticalpreparationforlungcancertreatment.

KeyWordsRuiZhen；Lungcancer；Proliferation；Apoptosis；Invading；Efficacyenhancingandtoxicityreducing；Raf/MEK/ERK；FAK/p38

中图分类号：R284；R734.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.049

癌症是当前世界对人类健康和生命威胁最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已跃居各类疾病的前列。肺癌为我国癌症发病率、死亡率第1位，2017中国癌症最新数据显示，我国平均每分钟就有7个人患癌症[1]。2013年我国肺癌发病人数占全球恶性肿瘤死亡人数的35.78%，死亡人数占全球的37.55%[2]。化学治疗仍是肺癌患者常用的治疗方式，虽然目前有针对EGFR、ALK等靶点的化疗药物用于肺癌治疗，但由于其耐药和不良反应的产生，化疗药物对肺癌的临床治疗效果不理想。在中医药治疗肿瘤方面，中药可以通过多途径、多靶点发挥抗肿瘤作用，同时具有不良反应少、机体耐受性好等优势。我国采用中药联合化学药物治疗晚期恶性肿瘤具有悠久的临床历史，目前该治疗方式已成为临床常用的方法[3-4]。天然药物中存在许多具有抗癌活性的物质。睿臻是以山楂、沙棘和枸杞三味中药为主，并添加虫草素、虫草多糖、β-葡聚糖和番茄红素等制备而成的天然药物组方，此复方的抗肿瘤作用未见报道。本研究主要利用肿瘤细胞及小鼠移植瘤模型评价睿臻的体内外抗肿瘤活性，并对其生物学功效及作用机制进行初步探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞人乳腺癌细胞株MCF-7，人髓母细胞瘤Daoy，人肺癌细胞株A549、NCI-H460和NCI-H1975，人胰腺癌细胞株BxPC3和人胶质母细胞瘤细胞株U-87MG购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心；人肾癌细胞株Caki-1由TehBinTean（DUKE-NUSMedicalSchoolSingapore）馈赠；人胶质母细胞瘤细胞株T98G购自上海复祥生物科技有限公司。

1.1.2动物雄性C57BL/6小鼠，体重16.0～18.0g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（合格证号：SCXK（京）2014-0004）。

1.1.3药物睿臻为棕黄色粉末，由青海睿元药物研究所有限责任公司提供；紫素（Taxol，北京协和药厂，批号：151107）；顺铂（Cisplatin，DDP，上海伊卡生物技术有限公司，批号：15663-27-1）；索拉非尼（Sorafenib，上海蓓琅生物科技有限公司，批号：284461-73-0）；吉西他滨（Gemcitabine，武汉东康源科技有限公司，批号：95058-81-4）；吉非替尼（Iressa）由中国医学科学院药物研究所冯志强研究员课题组提供。

1.1.4试剂与仪器青霉素钠盐及硫酸链霉素由华北制药股份有限公司生产。DMEM培养基和MEM培养基均购自Gibco公司，RPMI-1640培养基购自北京钮因华信科技发展有限公司，胰蛋白酶购自北京莱博生物实验材料研究所，胎牛血清购自北京元享圣马生物技术研究所。牛血清白蛋白第五组分（BSA）购自美国Amresco公司。十二烷基磺酸钠（SDS）、过硫酸铵、聚丙烯酰胺、焦碳酸二乙酯、琼脂糖、甘氨酸均购自美国Sigma公司。Transwell小室购置美国Corning公司。苏木精-伊红（HE）染色液购自北京益利精细化学品有限公司。乙二胺四乙酸钠（EDTA）、二甲基亚砜（DMSO）、无水甲醇、异丙醇由北京化工厂生产。溴化四氮唑蓝（MTT）、RIPA组织/细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Tween-20及溴酚兰由北京索莱宝科技有限公司提供。甲叉双丙烯酰胺（N，N′-Methylen-bis-Acrylamide）購自Fluka公司。ECL超敏显色剂购自北京普利莱公司。抗体均购于美国CellSignalingTechnology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗购自中杉金桥生物技术有限公司。体外实验均用二甲基亚砜（DMSO）配制，并用DMSO作为溶剂对照，终浓度不超过0.1%。体内实验睿臻用双蒸水溶解，阳性药（Taxol和DDP）用生理盐水配制。MEK-6318K血球计数仪购自北京瑞博赛工贸有限公司；C6流式细胞仪购自ACCURI公司；BioTek96孔单功能发光检测器购自美国PROMEGA公司，IX70倒置显微镜购自OLYMPUS公司，生物分子成像仪LAS4000购自美国GE公司。

1.2方法

1.2.1分组与模型制备无菌条件下，剥离传代于小鼠腋下的Lewis肺癌肿瘤，去除筋膜，剪碎，研磨，用无菌生理盐水按1∶3比例稀释后制成浓度为5×107个/mL的肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋下接种0.2mL瘤液。接种后次日动物随机分组，称重[6]。在小鼠Lewis肺癌移植瘤实验中，动物共分8组，分别为正常对照组（未荷瘤）和溶剂对照组，阳性药Taxol给药组，睿臻给药组3个（2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg），联合给药组2个，2.25g/kg、4.5g/kg睿臻分别与15.0mg/kgTaxol联合。

在小鼠Lewis肺癌生命延长实验中，实验动物共分5组，分别为溶剂对照组，阳性药组，DDP（5mg/kg）+Taxol（20mg/kg），睿臻3个剂量组，2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg。

1.2.2给药方法1）在小鼠Lewis肺癌移植瘤实验中，正常对照组（未荷瘤）和溶剂对照组，每天灌胃双蒸水，0.4mL/20g，2次/d；阳性药Taxol给药组，15.0mg/kg，腹腔注射，0.2mL/20g，1次/3d，共给药3次；睿臻给药组3个（2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg）灌胃，0.4mL/20g，2次/d；联合给药组2个，2.25g/kg、4.5g/kg睿臻分别与15.0mg/kgTaxol联合；睿臻接种前给药5d，接种后给药9d。

在小鼠Lewis肺癌生命延长实验中，溶剂对照组，0.4mL/20g，2次/d，灌胃；阳性药组，DDP（5mg/kg）+Taxol（20mg/kg），腹腔注射，0.2mL/20g，1次/周，共给药4次；睿臻3个剂量组，2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg，灌胃，0.4mL/20g，2次/d，共给药29d；溶剂对照组给予等体积蒸馏水。

1.2.3检测指标与方法

1）MTT法测定肿瘤细胞存活率：取对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为1.5×104细胞/mL的细胞悬液，按1500个/孔接种于96孔板，每孔100μL。次日加入不同浓度睿臻及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加入100μL（DMSO终浓度<0.1%）。样品设3～6个剂量组，每组设3个平行孔。于37℃培养箱继续培养120h后，弃上清液，每孔加入新鲜配制的含0.5mg/mLMTT的无血清培养基100μL，继续培养4h后弃上清液，每孔加入200μLDMSO溶解甲臜沉淀，微型振荡器振荡混匀后，检测波长570nm条件下测定吸光度值（A570）[5]，以溶剂处理的肿瘤细胞为溶剂对照组，按下列公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按照中效方程计算IC50。抑制率（%）=（A570溶剂对照组-A570给药组）/A570溶剂对照组×100%。以上实验重复3次。

2）小鼠Lewis肺癌移植瘤实验：实验结束，眼眶取血检测血细胞个数，处死动物，称体重，剥取胸腺及肿瘤组织、称重。根据重量计算胸腺指数，肿瘤抑制率（%），用均值±标准差（±s）表示，并进行各给药组与阴性对照组之间的t检验。小鼠Lewis肺癌移植瘤部分肿瘤组织于-80℃冰箱保存用于后续机制研究。

在小鼠Lewis肺癌生命延长实验中，每周称2次体重及肿瘤体积，每天记录动物存活只数，根据肿瘤体积计算肿瘤抑制率（%），用均值±标准差（±s）表示，并进行各给药组与阴性对照组之间的t检验。

3）重组基质膜侵袭运动实验：在Transwell小室的聚偏氟乙烯（PVPF）膜外表面涂10μLFibronectin（0.5μg/μL），置超净台内风干。在膜的内面涂10μLMatrigel（0.5μg/μL），超净台内吹干备用。在24孔培养板内加入10%FBS-DMEM，每孔600μL。用1mmol/LEDTA收集对数生长期的肿瘤细胞，悬浮于含0.1%BSA-DMEM培养基中，终浓度为2×106个/mL。将细胞悬液加到Transwell细胞培养小室中，每小室200μL。将小室浸于24孔板的条件培养基中，37℃，5%CO2温箱内孵育18h。将Transwell取出，滤膜用甲醇固定10min，苏木精-伊红（HE）染色，水洗，用棉签擦掉未穿过膜的细胞，用二甲苯透明后将膜封于载玻片上，于400倍显微镜下计数侵袭细胞数，每膜计数上中下左右5个不同视野的透过细胞数，计算平均值，每组平行设3孔。以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。抑制率（%）=（对照组侵袭细胞数-给药组侵袭细胞数）/对照组侵袭细胞数×100%。

4）流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡情况：睿臻处理肺癌细胞72h后，将细胞用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗2遍，胰蛋白酶-EDTA消化，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基终止消化。4℃，800r/min离心5min收集细胞，以PBS重悬，镜下计数后，取2×106个细胞，将其置于70%乙醇中于-20℃冻存24h以上，之后于4℃，800r/min离心5min，彻底去除乙醇。PBS洗2遍并悬浮之，加入PI染液（0.1mg/mLPI，0.02mg/mLRNaseA，1mg/mL柠檬酸钠和0.3%TritonX-100），摇匀后于37℃避光放置0.5h，经300目筛过滤，在ACCURIC6流式细胞仪上计数10000个细胞，分析细胞凋亡情况。

5）WesternBlot检测分析蛋白表达：取小鼠Lewis肺癌移植瘤实验中-80℃冰箱保存的3组（荷瘤溶剂对照组，睿臻4.5g/kg、9.0g/kg）瘤组织，每组3只研磨，组织裂解液冰上裂解1h，12000r/min离心30min，提取总蛋白，于-80℃储存备用。采用BCA法，以一定浓度梯度的BSA溶液为标准，于570nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，同时测定样品的吸光度值，计算蛋白水平，之后用组织裂解液将各样品调至相同浓度。进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白电转移实验[5]。将PVDF膜以含有5%脱脂奶粉的TTBS（0.1%Tween-20，10mmol/LTris-HCl，pH7.5，150mmol/LNaCl）室温封闭非特异结合位点2h。将膜与稀释的指定的一抗4℃孵育过夜，TTBS液洗膜3次。将膜移入二抗工作液（用TTBS液按1∶5000稀释HRP标记的二抗），室温反应1h。TTBS液洗膜3次，加入化学发光底物反应液，ECL照相系统照相[5-6]。

1.3统计学方法采用SPSS18.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料用均值±标准差（±s）表示，进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1睿臻对肿瘤细胞的生长抑制作用采用MTT法检测睿臻对肿瘤细胞作用120h后的增殖抑制作用。睿臻的MTT结果显示，睿臻对体外培养的肺癌细胞株、肾癌细胞株、乳腺癌细胞株、胶质母细胞瘤细胞株的增殖均有一定的抑制作用。其中，睿臻对肺癌细胞株的生长抑制作用最为明显，对A549细胞株、NCI-H460细胞株和NCI-H1975细胞株的IC50值分别为（98.42±1.21）μg/mL、（60.02±1.77）μg/mL和（60.41±2.56）μg/mL，在后续研究中选择肺癌继续进行生物学功能的研究及机制探讨。见表1。

2.2睿臻对小鼠移植瘤Lewis肺癌的生长及中位生存期的影响

采用小鼠Lewis肺癌移植瘤模型进一步考察睿臻的体内抗肿瘤作用。睿臻可剂量依赖性抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长，与溶剂对照组比较，睿臻2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg3个剂量的抑制率分别为33.8%、39.9%和70.00%（P<0.001）。睿臻不仅可以抑制小鼠Lewis肺癌的生长，还可延长Lewis肺癌荷瘤小鼠的中位生存期。如表3所示，与溶剂对照组比较，阳性药组对降低荷瘤小鼠的中位生存期，为21d；而睿臻4.5g/kg和9.0g/kg剂量组均可明显延长荷瘤鼠的中位生存期，其分别为26d和27d，而溶剂对照组中位生存期为24.7d。在本实验中，溶剂对照组荷瘤小鼠在接种第10天，肿瘤体积为（1998.71±356.30）mm3；而在睿臻9.0g/kg剂量组中，肿瘤体积为（749.35±355.05）mm3，抑制率达到62.51%（P<0.001），提示睿臻在抑制小鼠肺癌生长的同时可延长荷瘤小鼠的生存时间。见表2，图1。

在小鼠Lewis肺癌移植瘤模型中，睿臻不仅对肿瘤生长具有较强的抑制作用，还可增强Taxol的抗肿瘤活性。与溶剂对照组比较，15.0mg/kgTaxol对小鼠Lewis肺癌生长的抑制率为43.4%（P<0.001）；灌胃给予2.5g/kg、4.5g/kg睿臻对小鼠Lewis肺癌的生长抑制率分别为33.8%和39.9%（P<0.001），而当与15.0mg/kgTaxol联合应用时抑制率可分别达到55.8%（P>0.05，与单独使用Taxol组比较）和58.0%（P<0.05，与单独使用Taxol组比较），提示睿臻与Taxol具有协同效应。见表2，图1。

胸腺是T细胞分化、发育、成熟的场所，其功能与免疫紧密相关，胸腺指数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱。本研究通过比较各组动物间的胸腺指数以考察睿臻對荷瘤小鼠免疫系统的影响。与正常小鼠比较，荷瘤小鼠的胸腺指数明显降低（P<0.05）；与溶剂对照组比较，睿臻在4.5g/kg和9.0g/kg剂量下，可升高荷瘤小鼠的胸腺指数。阳性药Taxol给药组可引起荷瘤小鼠胸腺指数的进一步降低（P<0.05，与溶剂对照组比较）。当4.5g/kg睿臻与Taxol联合使用时，与阳性药Taxol给药组比较，荷瘤小鼠的胸腺指数明显升高（P<0.05）。因此推测睿臻可以改善Taxol对荷瘤小鼠所造成的免疫功能抑制。见图2。

为了初步观察睿臻在治疗中的不良反应，本研究观察了单独使用睿臻及与Taxol联合使用时对Lewis肺癌小鼠外周血计数的影响。与正常小鼠比较，荷瘤小鼠外周血中的白细胞数量显著升高（P<0.001），而红细胞数量及血红蛋白水平显著降低（P<0.001）；阳性药Taxol可降低荷瘤小鼠外周血中的血红蛋白水平，对红细胞数量无明显影响（P>0.05）。与溶剂对照组比较，睿臻各剂量组均可升高外周血中的红细胞数量及血红蛋白水平；此结果提示，睿臻对荷瘤小鼠外周血无明显的不良反应，且可升高化疗后的红细胞及血红蛋白数量。见表4。

2.3睿臻对肺癌细胞凋亡的影响

为了进一步验证睿臻对肺癌细胞的作用，本文采用流式细胞术检测睿臻对肺癌细胞凋亡的影响。睿臻处理A549和NCI-H460细胞72h后，凋亡细胞数剂量依赖性增加。在A549细胞中，在48.0μg/mL和96.0μg/mL剂量下，凋亡细胞所占比例分别为（20.37±4.40）%和（31.17±2.25）%，而溶剂对照组凋亡细胞比例为（12.93±2.00）%。在NCI-H460细胞中，当睿臻剂量为60.0μg/mL，120.0μg/mL时，可分别引起（14.00±2.69）%和（31.27±8.83）%的细胞凋亡，对照组凋亡率仅为（7.23±2.31）%。上述结果表明，睿臻可有效地诱导肺癌细胞发生凋亡。见图3。

2.4睿臻对A549和NCI-H460细胞侵袭能力的影响

采用重组基质膜侵袭实验观察对肺癌细胞侵袭能力的影响，在96.0μg/mL和192.0μg/mL剂量下，睿臻可显著减少A549细胞和NCI-H460细胞穿过重组基底膜的数量。在A549细胞中，对肿瘤细胞侵袭的抑制率分别为（66.0±1.54）%和（80.2±3.59）%；在NCI-H460细胞中，抑制率分别为（70.54±1.68）%和（83.5±6.08）%。在250.0μg/mL劑量下，睿臻作用18h对A549和NCI-H460细胞的生长抑制率仅为（13.00±2.22）%和（11.89±14.60）%，而侵袭实验中选用最大浓度为192.0μg/mL，说明睿臻抑制A549和NCI-H460细胞侵袭的活性可能不是由抑制细胞生长造成的。见图4。

2.5睿臻对小鼠Lewis肺癌组织内蛋白表达水平的影响

细胞增殖的失控和细胞凋亡的抑制是肿瘤发生发展的重要基础。这两者共同引起体内细胞动态平衡的破坏[7]。上述研究结果表明，睿臻可明显抑制肺癌细胞增殖、侵袭转移，诱导肺癌细胞凋亡，为探讨其作用机制，采用WesternBlot方法检测药物对相关蛋白表达水平的影响。文献报道，c-Raf介导的信号转导通路能抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖和存活，且在肺癌的发生发展过程中具有重要的作用[8-11]，因此我们首先检测了睿臻对c-Raf相关蛋白活性的影响。睿臻可显著抑制Lewis肺癌组织内p-c-Raf（Ser289）、p-MEK和p-ERK1/2的蛋白表达，在4.5g/kg剂量下对MEK和ERK的总水平并无显著影响，但在9.0g/kg剂量下略降低两者的表达。进一步检测睿臻对肺癌组织内p53、c-caspase3和c-PARP等凋亡相关蛋白表达的影响[12-15]。本研究结果显示，睿臻可显著上调p53、c-caspase3和c-PARP的水平。提示睿臻可能通过阻滞Raf/MEK/ERK信号通路，促进凋亡相关蛋白的表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而抑制肺癌细胞增殖。见图5。

FAK/p38信号通路与细胞的侵袭转移能力密切相关[16-17]，为此进一步检测了睿臻作用后肺癌组织内FAK/p38信号通路相关蛋白表达情况。结果表明，睿臻能显著降低p-FAK（Tyr397）、p-p38MAPK和MMP2的表达，但在9.0g/kg剂量下，对FAK的总水平有明显的抑制作用，而对p38MAPK的总水平无显著影响。因此，我们初步推测睿臻抑制肺癌细胞的侵袭转移能力可能与其对FAK/p38信号通路的抑制作用有关。

3讨论

肺癌具有发病率高、死亡率高，易转移3大特点，且临床治疗难度大[18]。目前，化学治疗仍然是治疗晚期肺癌常用的治疗手段，但由于化疗易引起机体耐药及较严重的不良反应[3-4，19-21]，因此寻找安全有效治疗肺癌的方法和药物是各国科学家研究的热点和重点。中药具有多靶标的特点，在治疗上通常会产生药效叠加，毒性分散的效果[3，16，19]，所以预期中药复方会对癌症起到较好的治疗及辅助治疗的作用。山楂中含有山楂酸、果皮多酚及果肉多酚等多种抗癌物质[22-23]。沙棘不但在免疫调节方面发挥着重要的作用，同时还在抗癌抑瘤方面疗效显著[24]。枸杞多糖是枸杞中的主要成分，能够抑制多种肿瘤的生长，提高机体免疫力[25-26]。虫草素对肺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤细胞生长增殖均具有抑制作用[27]。因此研究以上述成分为主的天然药物组方——睿臻的抗肺癌作用及其机制研究具有重要的意义，且该组方的抗肺癌作用国内外未见报道。

本研究中发现睿臻对A549、NCI-H460和NCI-H1975肺癌细胞株具有较好的体外抑制活性，进一步体内研究结果表明其可抑制小鼠Lewis肺癌的生长，延长荷瘤鼠的中位生存期。目前，Taxol为主要的肺癌化疗药物，睿臻可增加Taxol的抗肿瘤活性，同时可升高荷瘤小鼠的胸腺指数，升高Taxol降低的胸腺指数，推测睿臻可通过调节荷瘤鼠的免疫功能进而发挥其抗肿瘤作用，且睿臻可能对Taxol造成的免疫抑制有一定的缓解作用。睿臻对荷瘤小鼠的外周血无明显不良影响，与化疗药物Taxol联合使用可以增加荷瘤鼠外周血中红细胞和血红蛋白的数量，提示睿臻有可能对化疗药物造成的造血功能损伤起到一定的缓解作用，因此睿臻与化疗药Taxol联用具有增效减毒的作用，为临床应用提供一定的依据。

睿臻可降低Lewis肺癌组织内c-Raf的磷酸化水平，导致MEK磷酸化及下游信号通路的显著抑制，表现为ERK磷酸化水平的明显下降，进而促进p53、c-caspase3和c-PARP的表达。Raf/MEK/ERK信号转导通路可促进细胞增殖，调控肿瘤细胞增殖及凋亡；在Raf/MEK/ERK信号通路的作用下，细胞内c-caspase-3、c-PARP表达水平降低，肿瘤细胞凋亡受到抑制。因此，睿臻可能是通过抑制肺癌组织内c-Raf的磷酸化水平，进而抑制Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白的表达，从而上调细胞凋亡蛋白的表达，发挥抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用。睿臻可降低肺癌组织内p-FAK（Tyr397）的水平，进而抑制p38MAPK磷酸化及下游信号通路蛋白MMP2等的表达。转移是肺癌致死的主要原因，这是临床上治疗肺癌的难点，也是肺癌研究的热点[21，28]。已有研究表明FAK/p38信号通路参与细胞的侵袭转移过程[16-17]，因此推测睿臻抑制肺癌细胞的转移的作用有可能与抑制FAK/p38MAPK信号通路相关。

本研究结果初步证明，睿臻可通过阻滞Raf/MEK/ERK和FAK/p38信号通路，发挥诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖及侵袭的作用。在显著抑制肿瘤生长的同时，睿臻对荷瘤小鼠的免疫功能及造血功能亦有一定的保护作用。睿臻在抑制肺癌的发生发展发面表现出较好的效果和广阔的应用前景，其抗肿瘤及免疫调节机制有待进一步研究，期望经过我们的努力，睿臻能够开发成为抗肿瘤的复方制剂，造福广大肿瘤患者。

参考文献

[1]本刊编辑部.2017年中国最新癌症数据[J].中国肿瘤临床与康复，2017，24（5）：574-574.

[2]GouvinhasC，DeMelloRA，OliveiraD，etal.Lungcancer：abriefreviewofepidemiologyandscreening[J].FutureOncol，2018，14（6）：567-575.

[3]陳一天，封冰.小细胞肺癌化疗耐药研究进展[J].医学研究生学报，2012，25（5）：515-519.

[4]陈瑜容，王文忠.艾迪注射液联合GP方案治疗晚期非小细胞肺癌的效果分析[J].中国当代医药，2014，21（15）：84-85，91.

[5]周琬琪，张莉婧，杨瀚泽，等.Aurora激酶抑制剂ZLJ213抗人结肠癌的作用[J].药学学报，2015，50（7）：854-860.

[6]LiY，TangK，ZhangL，etal.Themolecularmechanismsofanovelmulti-kinaseinhibitorZLJ33insuppressingpancreaticcancergrowth[J].CancerLett，2015，356（2PtB）：392-403.

[7]TorchiaEC，ZhangL，HuebnerAJ，etal.Aurorakinase-Adeficiencyduringskindevelopmentimpairscelldivisionandstratification[J].JInvestDermatol，2013，133（1）：78-86.

[8]PowellCA，HalmosB，Nana-SinkamSP.Updateinlungcancerandmesothelioma2012[J].AmJRespirCritCareMed，2013，188（2）：157-166.

[9]AntónI，MolinaE，Luis-RaveloD，etal.ReceptorofactivatedproteinCpromotesmetastasisandcorrelateswithclinicaloutcomeinlungadenocarcinoma[J].AmJRespirCritCareMed，2012，186（1）：96-105.

[10]WangZL，FanZQ，JiangHD，etal.SelectiveCox-2inhibitorcelecoxibinducesepithelial-mesenchymaltransitioninhumanlungcancercellsviaactivatingMEK-ERKsignaling[J].Carcinogenesis，2013，34（3）：638-646.

[11]CaiZ，YangF，YuL，etal.ActivatedTcellexosomespromotetumorinvasionviaFassignalingpathway[J].JImmunol，2012，188（12）：5954-5961.

[12]RathoreS，DattaG，KaurI，etal.Disruptionofcellularhomeostasisinducesorganellestressandtriggersapoptosislikecell-deathpathwaysinmalariaparasite[J].CellDeathDis，2015，6：e1803.

[13]ShaliniS，DorstynL，DawarS，etal.Old，newandemergingfunctionsofcaspases[J].CellDeathDiffer，2015，22（4）：526-539.

[14]WaltersJ，PopC，ScottFL，etal.Aconstitutivelyactiveanduninhibitablecaspase-3zymogenefficientlyinducesapoptosis[J].BiochemJ，2009，424（3）：335-345.

[15]GhavamiS，HashemiM，AndeSR，etal.Apoptosisandcancer：mutationswithincaspasegenes[J].JMedGenet，2009，46（8）：497-510.

[16]LiuYZ，YangCM，ChenJY，etal.Alpha-caroteneinhibitsmetastasisinLewislungcarcinomainvitro，andsuppresseslungmetastasisandtumorgrowthincombinationwithtaxolintumorxenograftedC57BL/6mice[J].JNutrBiochem，2015，26（6）：607-615.

[17]WagnerEF，NebredaAR.SignalintegrationbyJNKandp38MAPKpathwaysincancerdevelopment[J].NatRevCancer，2009，9（8）：537-549.

[18]邹小农，贾漫漫，王鑫，等.中国肺癌和烟草流行及控烟现状[J].中国肺癌杂志，2017，20（8）：505-510.

[19]ZhenYZ，HuG，ZhaoYF，etal.SynergyofTaxolandrheinlysinateassociatedwiththedownregulationofERKactivationinlungcarcinomacells[J].OncolLett，2013，6（2）：525-528.

[20]祝冰晶，周向東.PI3K/AKT通路在肺癌转移和耐药中的研究[J].中国肺癌杂志，2011，14（8）：689-694.

[21]NicholsL，SaundersR，KnollmannFD.Causesofdeathofpatientswithlungcancer[J].ArchPatholLabMed，2012，136（12）：1552-1557.

[22]JiaL，PopovichDG，HaoJ.HawthornFlavonoidExtract：AntioxidantActivityandGrowthInhibitionEffectonCancerCells[J].FoodScience，2010，31（3）：220-223.

[23]李婷.山楂果皮、果肉多酚抑制MCF-7细胞的活性及促进NO_2～-还原释放NO的作用[D].西安：陕西师范大学，2014.

[24]郑玉，张宏方，于东波，等.沙棘抗肿瘤及相关免疫研究进展[J].中国中医药现代远程教育，2016，14（17）：150，封3-封4.

[25]杨毅，蒋兰.枸杞多糖抗肿瘤作用及机制研究进展[J].亚太传统医药，2017，13（22）：79-82.

[26]郭培培.枸杞多糖的抗肿瘤作用及其机理研究现状[J].北京联合大学学报，2011，25（4）：26-29，40.

[27]TianX，LiY，ShenY，etal.Apoptosisandinhibitionofproliferationofcancercellsinducedbycordycepin[J].OncolLett，2015，10（2）：595-599.

[28]TalmadgeJE，FidlerIJ.AACRcentennialseries：thebiologyofcancermetastasis：historicalperspective[J].CancerRes，2010，70（14）：5649-5669.

（2018-03-28收稿责任编辑：杨觉雄）