吉林省不同产地万年蒿中东莨菪内酯HPLC含量测定

徐 犇，李 纳，刘吉爽，张雅蓉，徐文慧，陈 新，邱智东

（长春中医药大学，长春 130117）

万年蒿为菊科植物白莲蒿（Artemisia sacrorum Ledeb.）的干燥地上部分，全草入药。除高寒地区外，几乎遍布全中国，各地均有分布，资源分布广泛[1]，尤其吉林省长白山区域蕴藏量丰富。味苦，辛，性平，入肝，肾经，具有清热解毒，凉血止血之功效。《新编本草纲目》言其“全草：味苦，性寒。有清湿热、利尿、止血的功能。用于黄疸，流感。”民间入药，有清热、解毒、祛风、利湿之效，用于治疗急慢性肝炎、小儿惊风、发烧、阑尾炎、急慢性胃肠炎、妇女内寒证等，可作“茵陈”代用品[2]，又作止血药。牧区作牲畜的饲料[3]。万年蒿中含有多种化学成分，如黄酮类、肉桂酸类、香豆素类、萜类、多糖、挥发油等成分[4-9]。本文采用HPLC进行了万年蒿中东莨菪内酯的含量测定方法研究，选取东莨菪内酯（C10H8O4）为万年蒿含量测定指标。东莨菪内酯具有抗炎、抗菌[10]等作用，是万年蒿中的重要活性成分[11-13]。不同产地万年蒿中东莨菪内酯的含量存在较大的差异。本研究建立HPLC 测定万年蒿中东莨菪内酯含量的方法，操作简便，重现性好，分析快速准确，可为万年蒿的质量评价及资源开发提供依据。

1 仪器与试药

1260型HPLC仪（美国Agilent公司）；TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；FA1204B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ-250DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HWS12型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；SHZ- Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；万能高速粉碎机（浙江红景天工贸有限公司）。

东莨菪内酯对照品（批号：110768-200504）由中国食品药品检定研究院提供；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：WondaSil C18 （4.6 mm×250 mm，5 µm）； 流 动 相：A为 甲 醇，B为0.3%磷酸溶液，梯度洗脱条件：0～40 min（24%A→24% A），40～41 min（24% A→75% A），41～70 min（75% A→75% A）；柱温：35℃；检测波长：344 nm；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 µL。

2.2 对照品溶液的制备 取东莨菪内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含15 µg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备方法的选择

2.3.1 不同提取溶剂的考察 取同一批药材粉末（过二号筛）6份，取1 g，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。注入液相色谱仪，结果显示甲醇溶液作溶剂提取含量最高为0.071%，所以选择甲醇溶液作为提取溶剂。

2.3.2 不同提取方法的考察 以甲醇为提取溶剂，分别采用超声提取1 h和加热回流提取1 h提取，结果超声法提取东莨菪内酯含量为0.067%，加热回流法提取东莨菪内酯含量为0.071%。结果表明，加热回流提取效率较高，所以选择加热回流为提取方式。

2.3.3 提取溶剂体积考察 以甲醇为提取溶剂，对提取溶剂体积25、50、100 mL分别进行考察，测定东莨菪内酯含量结果依次为0.063%、0.070%、0.071%。结果表明，提取溶剂25 mL的提取率比50 mL的提取率低，而50 mL与100 mL无显著性差异，且考虑成本，所以确定提取溶剂量为50 mL。

2.3.4 提取时间的考察 以甲醇为提取溶剂，对回流时间30、60、120 min进行了比较，测定东莨菪内酯含量结果依次为0.067%、0.071%、0.071%。结果表明，提取时间为60 min与120 min提取率相当，所以确定提取时间为60 min。

2.3.5 供试品溶液制备的确定 根据以上考察结果，确定供试品溶液的制备方法为取本品粉末（过二号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系和范围 精密称取东莨菪内酯对照品适量，加甲醇溶液溶制成每1 mL含东莨菪内酯75 μg的溶液，即得。分别精密吸取上述东莨菪内酯对照品溶液1.0、2.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0 mL 于 25 mL量瓶中，用甲醇定容，即得。按2.1项下的色谱条件精密吸取上述对照品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，依法测定，以对照品的浓度（μg/mL）为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程为：Y = 39.179 X -3.532 7，相关系数r = 0.999 9，结果表明，东莨菪内酯在3.016～36.192 µg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.4.2 专属性试验 为进一步考察试验的合理性，按照供试品溶液制法制得不含样品的阴性对照溶液，依法测定，结果阴性对照液在与对照品峰相应的保留时间处无干扰峰出现，表明本方法具有良好的专属性。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、6、12、18、24 h精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，计算东莨菪内酯含量，结果显示东莨菪内酯峰面积的RSD为0.79%。表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。2.4.4 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，记录峰面积，计算东莨菪内酯含量，结果显示东莨菪内酯峰面积的RSD为0.90%。表明本方法所用仪器精密度良好。

2.4.5 重复性试验 取同一批万年蒿药材6份，按2.3.5项下方法平行制备，独立测定6份，测得东莨菪内酯含量，结果显示东莨菪内酯的含量的RSD为1.80%。表明本方法的重复性良好。见表1。

表1 重复性试验结果（n = 6） %

2.4.6 准确度试验 取同法测定已知含量的万年蒿药材6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入适量东莨菪内酯对照品溶液，按2.3.5项下方法平行制备， 按2.1项下色谱条件测定，测定东莨菪内酯的含量，计算回收率，结果平均回收率为105.53 %，RSD 值为 1.54 %。2.4.7 耐用性试验

2.4.7.1 不同厂家色谱柱的考察 取样品溶液分别在三根不同厂家的C18色谱柱，按2.1项下色谱条件测定，结果色谱柱WondaSil C18、色谱柱Agilent TC-C18与色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18分离效果均良好，三根色谱柱的理论塔板数按东莨菪内酯含量计算＞3 000，表明该方法稳定可行。

2.4.7.2 不同柱温的考察 取样品溶液分别在柱温30、35、38 ℃，按2.1项下色谱条件测定，结果柱温为33、35、38 ℃ 条件下，东莨菪内酯均可以分离完全，并且理论塔板数按东莨菪内酯计算均＞3 000，测定结果较为稳定，该方法可行。

2.4.7.3 不同流速的考察 取样品溶液分别在流速0.8、0.9、1.0 mL/min，按2.1项下色谱条件测定，结果在不同流速下，东莨菪内酯的分离效果均良好，理论塔板数按东莨菪内酯计算均＞3 000，测定结果较为稳定，该方法可行。

2.5 样品含量测定 取 13 批吉林省不同产地的万年蒿药材各适量，按2.3.5项下方法制备供试品溶液，再按上述方法和色谱条件测定，记录峰面积，按外标法计算东莨菪内酯的含量。结果见表2。

表2 吉林省不同产地万年蒿中东莨菪内酯的含量测定结果

3 讨论

3.1 测定波长选择 分别取东莨菪内酯对照品溶液和供试品溶液，以甲醇为空白溶液校正，应用紫外-可见分光光度法，在200～400 nm波长范围内进行全波长扫描，均在344 nm波长处有最大吸收，并且《中华人民共和国药典》各药材项下高效液相色谱法测定东莨菪内酯含量测定波长均为344 nm，故确定东莨菪内酯检测波长为344 nm。

3.2 流动相色谱条件考察 在对流动相色谱条件进行考察时，参考《中华人民共和国药典》华山参药材中东莨菪内酯的含量测定项，选择甲醇- 0.3%磷酸溶液为流动相，经试验调整多种不同流动相的比例，考察色谱图分离情况，结果供试品整个色图谱中出现密集的杂峰，连续不断，即使延长一次分析时间300 min，杂峰仍然连续不断出现。为节省分析时间，经调整比较多种比例的梯度系统，综合考虑色谱分离效果、主要色谱峰的特征和重现性，最终选取了文中的流动相梯度系统。

3.3 供试品溶液的制备方法研究 在试验中，比较了乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇和 30%甲醇 6 种不同的提取溶剂，考察了不同提取溶剂加入量，对比了回流提取、超声提取2 种不同的提取方法，考察了不同提取时间对其含量测定的影响，最终选取甲醇为提取溶剂，提取方法选择加热回流提取方法，提取溶剂量为50 mL，提取时间为1 h，确定了供试品溶液的制备方法。

3.4 分析方法的验证研究 按《中华人民共和国药典》有关规定，进行了一系列方法学考察包括线性范围、专属性、稳定度、精密度、准确度和耐用性等，结果表明，本文所建立万年蒿中东莨菪内酯的含量测定方法灵敏，精密度高，重复性好，结果准确，专属性强，具有很好的耐用性，可作为该品种的质量控制方法，并可为今后万年蒿药材及其制剂的质量评价提供参考。

3.5 样品含量测定结果分析 本研究共收集了13 批吉林省不同产地的万年蒿药材，研究结果显示，吉林省不同产地万年蒿中东莨菪内酯的含量存在较大差异，含量范围为0.026%～0.117%。可能与产地的自然环境、气候等有较大的相关性。除此之外，东莨菪内酯的含量可能还与万年蒿药材采集时间有关。通过对比，8月份采集的万年蒿中东莨菪内酯的含量明显高于9月份。为确定东莨菪内酯含量与万年蒿药材采集时间是否存在相关性，还需进一步研究。