不同采收期红旱莲中金丝桃苷的含量测定

李 纳，刘吉爽，张雅蓉，徐 犇，徐文慧，陈 新

（长春中医药大学，长春 130117）

红旱莲（Hypericum aseyron L.）为藤黄科金丝桃属植物，药用其全草。分布于我国东北地区及黄河、长江、珠江流域，生于荒坡、山野、路边[1]。红旱莲中以金丝桃苷为代表的黄酮类化合物，其提取物具有抗炎、镇痛、抗氧化、组胺释放抑制等作用[2-12]。该药材未收载于《中华人民共和国药典》（2015版）[13]中，药材标准目前仅收载于《吉林省药品标准》（1977年版）、《上海市中药材标准》（1994年版）中，年代久远，已不能满足市场对药材质量控制的需求。由于药材质量控制上的缺失，近年来，吉林省内未见有医院进行使用，且未见有药材商品流通。现测定不同采收期红旱莲药材中目标成份含量，为确定药材最佳采收期提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 AE 240型电子天平（上海精密科学仪器有限公司），HC-TP12B架盘药物天平（上海医疗器械八厂），Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent公司），KQ-250B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂），DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），ZF-2C型暗箱式自动紫外分析仪（上海安灵电子仪器厂），硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂），DFT150小型粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）。

1.2 材料与试剂 金丝桃苷对照品（批号：111521-201708，纯度94.3%，中国食品药品检定研究院），红旱莲6批，经长春中医药大学张景龙教授鉴定均为藤黄科金丝桃属植物黄海棠（Hypericum ascyron L.）的干燥地上部分，采集情况，见表1。

表1 试验用红旱莲样品采集情况

二氯甲烷（分析纯，北京化工厂），乙醇（分析纯，北京化工厂），甲醇（分析纯，北京化工厂），甲酸（分析纯，北京化工厂），磷酸（色谱纯，天津市光复精细化工研究所），乙腈（色谱纯，德国Merck公司），三氯化铝（分析纯，沈阳市试剂三厂），娃哈哈纯净水（天津娃哈哈饮料宏振有限公司），纯化水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备 取本品粉末0.1 g，加甲醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2 对照药材溶液的制备 取红旱莲对照药材0.1 g，加甲醇10 mL，超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，制成对照药材溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 取金丝桃苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.4 薄层条件 照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～10 μL、对照药材溶液5 μL、对照品溶液3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上使成条状，以二氯甲烷-甲醇-甲酸-水（10：6：1：2.5）下层为展开剂，薄层板置展开缸中预平衡20 min ，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。

2.2 高效液相供试品溶液制备法的选择

2.2.1 紫外全波长扫描 取金丝桃苷对照品溶液，以60 %乙醇为空白溶液校正，照紫外-可见分光光度法，在200～800 nm波长范围内进行全波长扫描。结果表明，金丝桃苷在360 nm处有最大吸收，故确定以金丝桃苷的检测波长为360 nm。

2.2.2 流动相色谱条件考察 本试验设计参考文献[9-11]以及《中华人民共和国药典》[13]中以金丝桃苷为含测指标的方法，最终以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，进行梯度洗脱。

2.2.3 提取溶剂考察 对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加60 %乙醇制成每1 mL含25 µg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取同一批药材粉末（过3号筛）3份，取1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入60 %乙醇、甲醇、30 %乙醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用60 %乙醇、甲醇、30 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 结果表明，60 %乙醇溶液作溶剂提取结果较高，所以选择60 %乙醇溶液作为提取溶剂。

2.2.4 提取方式考察 取同一批药材粉末（过3号筛）2份，每份约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入60 %乙醇50 mL，密塞，称定重量，选择2种方式提取：100 ℃加热回流提取、超声提取（超声功率300 W，频率45 kHz）各1 h，补足重量，摇匀，滤过，即得。结果表明，加热回流提取效率较高，所以选择加热回流为提取方式。

2.2.5 提取溶剂体积考察 取同一批药材粉末（过3号筛）3份，每份约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入60 %乙醇25、50、100 mL，密塞，称定重量，分别回流提取2 h，补足重量，摇匀，滤过，对提取溶剂体积进行考察。结果表明，提取溶剂为25 mL的提取率与50 mL相比提取率低，而50 mL与150 mL及100 mL无显著性差异，所以确定提取溶剂量为50 mL。

2.2.6 提取时间考察 取同一批药材粉末（过3号筛）3份，每份约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入60 %乙醇50 mL密塞，称定重量，分别选择：分别回流提取0.5、1、2 h，补足重量，摇匀，滤过，对提取时间进行考察，结果以1 h为最佳提取时间。

2.2.7 供试品制备方法确立 对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加60 %乙醇制成每1 mL含25 µg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品，研细（过3号筛），取1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入60 %乙醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用60 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性及范围 精密称取金丝桃苷对照品适量，加60 %乙醇溶液溶制成每1 mL含金丝桃苷140 μg的溶液，即得。分别精密吸取上述金丝桃苷对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、7.0、10.0 mL于25 mL量瓶中，用60 %乙醇定容，即得。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为360 nm；理论板数按金丝桃苷峰计算应不低于3 000。

2.3.2 测定方法 精密吸取上述对照品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，依法测定，以对照品的浓度（μg/mL）为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以对照品的峰面积为纵坐标（Y），对照品的浓度（μg/mL）为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程金丝桃苷Y = 21.919 X + 7.584 6，r = 0.999 7，线性范围5.476 9～54.769 4 µg/mL，结果表明，在5.4769～54.769 4 µg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 专属性试验 为进一步考察试验的合理性，按照供试品溶液制法制得不含样品的阴性对照溶液，依法测定，结果阴性对照液在与对照品峰相应的保留时间处无色谱峰，表明无干扰，专属性好。

2.3.4 重复性试验 取同一份红旱莲药材（HHL3），按正文拟定的方法制备供试品溶液6份，测定金丝桃苷的含量，结果金丝桃苷平均含量为0.13%，RSD为1.72%（n = 6）；说明本方法的重复性良好。

2.3.5 溶液稳定性试验 同一份供试品溶液（HHL3），按正文拟定的色谱条件，每隔一定时间测定1次，共考察24 h，测定6次，结果6次测定金丝桃苷平均峰面积为539.025 9，RSD % 为 0.45 %（n = 6）。

2.3.6 准确度试验 精密量取同法测定已知含量的供试品（HHL3）6份，每份约1 g，精密称定，分别精密加入金丝桃苷对照品60 %乙醇溶液50 mL（浓度20.30 μg/mL），按供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算回收率，平均回收率为96.75 %。

2.3.7 精密度试验 对同一份供试品溶液（HHL3），按正文拟定的色谱条件，连续测定6次，结果金丝桃苷的平均峰面积为537.498 8，RSD %为0.20%（n = 6）。

2.3.8 耐用性试验 不同柱温、不同流速、不同厂家色谱柱的考察：取样品溶液分别在两根不同厂家的C18色谱柱上，在柱温25、30、35 ℃，在流速0.8、0.9、1.0 mL/min，按正文的方法，进样，测定，结果见表2。

表2 耐用性试验结果（n = 2）

2.3.9 样品测定及限度确定 取6批不同产地的红旱莲药材，按“含量测定”项下方法操作，测定含量，见表3。

结果表明，金丝桃苷含量为0.053%～0.132%，平均值为0.092%，考虑药材采收时间不同，生长状态不同，所以目标产物含量差异较大。

表3 样品测定结果（n = 2）

3 小结

本研究依据中医药基本理论，选择以金丝桃苷为含测指标对红旱莲药材进行含量测定。通过对红旱莲药材功能主治的研究，发现红旱莲具有平肝、清肝火之效；其中作为主要药效物质基础之一的金丝桃苷具有明显的抗抑郁作用[14-15]。中医很早就将抑郁症的发病与肝脏联系在一起，其认为“世人因郁而致血病者多，凡郁皆肝病也，木中有火，郁甚则火不得舒，血不得藏而妄行”。这一观点为后世治疗肝郁之症奠定了理论基础[16-17]。因此，本研究选取金丝桃苷为红旱莲药材的质控指标。

对以上6批不同采收期的红旱莲药材含量测定结果进行分析，发现采收期为6、9月的2批红旱莲药材中金丝桃苷的含量相对较低，而7、8月份等4批红旱莲药材中含量测定指标金丝桃苷的含量较高，均在0.13%左右。该结论为确立红旱莲药材最佳采收期提供了科学依据。