不同时间煎煮防风对防风散中有效成分含量及药效学的影响

黄晓巍，李 鑫，吴月征，赵昕彤，叶豆丹，辛 国

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林省中药生物大分子重点实验室，长春 130117；3.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

防风散始载于《普济方》[1]：“防风、连翘、山栀子、甘草各等分，治小儿伤寒及诸热。兼治疮痘入目生翳。”防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk的干燥根，性微温、味辛甘，具有祛风解表、胜湿止痛等功效[2]。早于明代陶华所著《伤寒六书》中就有对防风入汤剂宜先煎的相关记载：“一用风病药，先煎防风一二沸，后入余药同煎”[3]，故认为防风入汤剂宜先煎，但在《中华人民共和国药典》（2015版）[4]中并未对其做出明确阐述。本文现通过观察防风先煎时间对防风散中的有效成分含量变化及药效学的影响，明确防风散中防风先煎的最佳时间，为防风的特殊煎煮方法在临床合理应用提供依据。

1 材料

1.1 动物 ICR小鼠，SPF级，雌性180只，雄性60只，体质量18～22 g，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号：SCXK（吉）2016-0003。

1.2 药物及试剂 升麻素苷对照品，上海源叶生物科技有限公司，批号B21157；，5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，上海源叶生物科技有限公司，批号 B21823；防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk，安国市辉发中药饮片加工有限公司，批号160901； 连 翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl，河北祁一堂药业有限公司，批号 1609017；栀子Gardenia jasminoides Ellis，河北祁一堂药业有限公司，批号 1704027；炙甘草G.glabra Linn，安国市辉发中药饮片加工有限公司，批号160809。感冒疏风片，吉林龙鑫药业有限公司，批号151008100；去痛片，长春大政药业科技有限公司，批号161235；枸橼酸喷托维林片，天津力生制药股份有限公司，批号1611014.08。

1.3 仪器 岛津高效液相色谱仪，十万分之一天平，万分之一分析天平，电热恒温鼓风干燥箱，超声波清洗器，煎药壶，恒温水浴锅，智能热板仪，隔离湿气超声波雾化器。

2 化学试验

2.1 对照品溶液的制备 精密称取防风有效成分标准品各5.00 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，稀释成含升麻素苷0.06 mg/mL，5-O-甲基维斯阿米醇苷0.06 mg/mL的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 精密称量防风50 g，加水500 mL浸泡30 min，另取连翘、栀子、甘草各50 g加1 000 mL水浸泡30 min，分别将防风先煎0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，9个煎煮时间的防风散浓缩干燥（80 ℃）至干膏（出膏率约为16.5%）研磨成粉末（过3号筛），精密量取粉末0.25 g，置500 mL锥形瓶中，量取甲醇10 mL，放入瓶中，称量总体质量记录，之后放在水浴上回流2 h，冷却至室温，称量总体质量与回流前对比，如果质量有所减少，加入甲醇补足重量，滤纸过滤，取续滤液即得9种不同煎煮时间的防风供试品溶液。阴性对照组溶液的制备[5]，取连翘、栀子、甘草各50 g加1 000 mL水浸泡30 min，煎煮20 min，按上述方法制备即得。

2.3 色谱条件 色谱柱：INERTSIL ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（40：60），柱温30 ℃，流速1 mL/min，检测波长254 nm，进样量10 μL。在选定的色谱条件下，防风有效成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数与拖尾因子符合《中华人民共和国药典》（2015版）[4]要求。结果见图1（插页二）、图2（插页三）、图3（插页三）。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性考察 精密量取防风有效成分标准品各5.00 mg，分别放入2个5 mL容量瓶中，加入甲醇摇晃使其充分溶解，然后定容。以此液为母液，分别精密移取，制成浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 2种标准品溶液，依2.3项下色谱条件进样。以浓度 X（mg/mL） 为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得出2种有效成分的回归方程分别为：

结果表明，防风2种有效成分在浓度为0.1～0.8 mg/mL 范围内与峰面积呈良好的线性关系[6]。

2.4.2 精密度试验 精密吸取2.1项下制备的对照品溶液10 μL，进行液相检测，连续进样6次。得到升麻素苷的RSD（n = 6）为0.71%，5-O-甲基维斯阿米醇苷的RSD（n = 6）为0.76%，结果表明，仪器精密度良好[7]。

2.4.3 稳定性试验 分别在 0、4、8、12、24、48 h精密吸取室温下放置的2.2项下防风先煎10 min的样品溶液10 μL，进样测定。以峰面积积分值为指标测定其稳定性，升麻素苷的RSD（n = 6）为 0.85%，5-O-甲基维斯阿米醇苷的RSD（n = 6）为 0.77%。表明防风散中的有效成分在48 h内稳定性良好[8]。

2.4.4 重现性试验 按照2.2项下煎煮6份防风先煎10 min的防风散，并进行样品处理，每份精密吸取10 μL进行检测。以回归方程计算升麻素苷含量平均值（n = 6）为5.686 mg/g，RSD（n = 6）为 1.08%。5-O-甲基维斯阿米醇苷含量平均值（n = 6）为 1.883 mg/g，RSD（n = 6）为 1.21%[9]。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已知有效成分含量为5.638 、1.909 mg/g的防风先煎10 min防风散浸膏6份，每份约0.05 g，分别加入相当于样品中2种主要成分含有量100%的对照品粉末，按2.2项下的方法制备供试品溶液。得到升麻素苷的回收率为100.4%，RSD（n = 6）为 1.21%。5-O-甲基维斯阿米醇苷的回收率为100.6%，RSD（n = 6）为 1.33%[10]。

2.4.6 样品含量测定 分别吸取2.2项下9个煎煮时间的防风散，按照2.3项下色谱条件进样10 μL测定[11]。9个样品中防风2种有效成分的含量，见表1。

表1 不同煎煮时间防风2种有效成分的含量 mg/g

3 药效学试验与结果

现代研究[12-14]表明，防风散具有明显镇咳、镇痛作用。故选择镇咳、镇痛2个指标进行不同时间煎煮防风的防风散的药效学实验。

3.1 药物制备 防风散的制备：称取防风50 g，加500 mL水浸泡30 min，另取约连翘50 g，栀子50 g，甘草50 g加1 000 mL水浸泡30 min，依2.2项下时间要求进行煎煮，并浓缩至含防风浓度为1 g/mL，放凉，备用。

阳性药物的制备：去痛片的制备，取药品粉末11.150 g，用水50 mL制成浓度为0.230 g/mL溶液备用。枸橼酸喷托维林片的制备，取药品粉末0.570 g，加水50 mL制成浓度为0.011 4 g/mL溶液备用。感冒疏风片的制备，取药品粉末40.00 g，加水50 mL，制成浓度为0.800 g/mL溶液备用。

3.2 动物分组及给药 镇痛实验，120只雌鼠随机分为12组，每组10只，即模型对照组，感冒疏风片组，去痛片组，不同煎煮时间的防风散9组（依2.2项下时间要求进行煎煮）及阴性对照组。镇咳实验120只鼠（雌雄各半）随机分为12组，每组10只，即模型对照组，感冒疏风片组，枸橼酸喷托维林片组及不同煎煮时间的防风散9组（依2.2项下时间要求进行煎煮）。按0.02 mL/g剂量对各组小鼠灌胃给药，模型对照组给予等体积的纯净水，连续给药7 d。

3.3 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。结果以均数±标准差（x± s ）表示，组间样本均数比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

3.4 镇咳实验 各组小鼠（雌雄各半）末次给药1 h后，将小鼠放入雾化器中，以25%氨水定量喷雾引咳，记录各组小鼠的咳嗽潜伏期（首次咳嗽的时间）和2 min内咳嗽次数[15-16]。

结果显示，与模型对照组比较，感冒疏风片组、枸橼酸喷托维林片组、防风先煎10、15、20、25 min组均可使小鼠咳嗽潜伏期明显延长（P＜0.05，P＜0.01）；感冒疏风片组、枸橼酸喷托维林片组、防风先煎10、15、20、25 min组均可使小鼠咳嗽次数减少（P＜0.05，P＜0.01），结果见表2。

3.5 镇痛实验 各组小鼠（雌性）末次给药1 h后，将小鼠置于（55±0.5）℃的智能热板仪上，记录其足底接触热板到出现舔后足或跳跃的时间[17-18]。

结果显示，与模型对照组相比，去痛片组、防风先煎10、15 min组小鼠的痛阈时间存在统计学意义（P＜0.01），感冒疏风片组、防风先煎5、20、25 min组的痛阈时间明显延长（P＜0.05），见表3。

表2 不同时间煎煮防风的防风散对小鼠的镇咳作用（x± s ，n = 10）

表3 不同时间煎煮防风的防风散对小鼠的镇痛作用（x± s ，n = 10）

4 小结

HPLC检测结果表明，防风散中的有效成分含量随煎煮时间延长而逐渐增加，至防风煎煮30 min（即先煎10 min）时候含量最高，之后随煎煮时间延长有效成分含量降低。可能原因主要为：随着煎煮时间改变，防风各有效成分之间可能产生分解反应、聚合反应等，也可能发生了有效成分之间的转化。药效学结果表明，与模型对照组相比，防风先煎10 min组小鼠的痛阈时间存在统计学意义（P＜0.01），防风先煎5、20、25 min组的痛阈时间明显延长（P＜0.05）；防风先煎10、15、20、25 min组均可使小鼠咳嗽潜伏期明显延长（P＜0.05，P＜0.01），其中煎煮30 min组的镇咳效果最为显著；感冒疏风片组、枸橼酸喷托维林片组、防风散防风先煎10、15、20、25 min组均可使小鼠咳嗽次数减少（P＜0.05，P＜0.01）。研究结果表明，防风散中防风有效成分的含量与防风的煎煮时间有关，且有效成分的含量变化直接影响了防风散的镇咳、镇痛的作用。综上所述，防风入汤剂宜先煎，最佳煎煮时间为30 min（即先煎10 min）。