龙胆中当药苷和獐牙菜苦苷的含量测定及指纹图谱研究

孙紫薇，翁丽丽，张 楠，陈 丽，侯晓琳

（长春中医药大学，长春 130117）

龙胆为条叶龙胆（Gentiana ma shurica Kitag.）、龙胆（Geniana scabra Bge.）、三花龙胆（Geniiarurtriflora Pall.）和滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.）的干燥根和根茎。前3种习称“龙胆”，后1种习称“坚龙胆”[1]。条叶龙胆主要分布于黑龙江、辽宁、吉林、山西、陕西、

山东等省；龙胆、三花龙胆主要分布于黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古等省；坚龙胆主要分布于四川、云南、贵州等省。龙胆最早记载于《神农本草经》，列为中品，梁代陶弘景《名医别录》也都有记载，在临床上，应用的制剂主要有龙胆泻肝丸（汤、颗粒）、龙胆散和龙泽熊胆胶囊等制剂[2]。龙胆中主要药效成分为环烯醚萜苷类[3-5]，具有抗炎镇痛[6-7]，健胃[8]，抗病毒[9]，抗肿瘤[10]，促进伤口愈合[11]等作用。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪Prominence-ILC-2030（岛津企业管理中国有限公司）；JA2603B电子天平（d = 0.000 1g）（上海天美天平仪器有限公司）；FA1004B电子天平（d = 0.000 01 g）（上海佑科仪器仪表有限公司）；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9053A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Water Purifier 实验室专用超纯水机；指纹图谱软件、统计软件SPSS。

1.2 试药

1.2.1 对照品 当药苷（规格：20 mg，购于中国食品药品检定研究院）；獐牙菜苦苷（规格：20 mg，购于中国食品药品检定研究院）。

1.2.2 试剂 甲醇分析纯（北京化工厂）；色谱甲醇（SK chemicals）；色谱乙腈（Fisher chemicals）；水为超纯水。

1.3 药材 以下材料收集后，置于阴凉处阴干，粉碎过筛，备用，所有采集药材经长春中医药大学药学院翁丽丽教授鉴定，均为龙胆（Geniana scabra Bge.）。见表1。

表1 龙胆不同来源材料

2 方法与结果

2.1 当药苷与獐牙菜苦苷含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取当药苷、獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇均制成每1 mL含0.025 mg的溶液，摇匀即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取龙胆粉末约0.2 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇4 mL，超声提取10 min，放冷后过滤，滤渣加入甲醇4 mL，再次超声提取10 min，放冷后，滤过。合并续滤液，滤液置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀即得。

2.1.3 色谱条件及色谱峰归属 色谱柱：Agilent Innoval C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水（20：80），流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 µL。 见图1（插页二）。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 取当药苷及獐牙菜苦苷对照品溶液，依次进样4、6、8、10、12、14 μL，按2.1.3项下测定相应峰面积，以对照品含量为横坐标（X），相应峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。见表2。

表2 回归方程、线性范围

2.2.2 精密度试验 分别吸取2.1.1项下当药苷及獐牙菜苦苷对照品溶液，按2.1.3色谱条件连续进样6次，每次进样10 µL，记录峰面积。当药苷RSD = 0.16%，獐牙菜苦苷RSD = 0.55%，结果表明，仪器具有良好的精密度。

2.2.3 稳定性试验 取同一龙胆供试品溶液，室温下放置0、2、4、6、12、24 h依法进行测定，记录峰面积。当药苷RSD = 0.37%，獐牙菜苦苷RSD = 0.48%。表明供试品溶液中的当药苷及獐牙菜苦苷在24 h内稳定。

2.2.4 重现性试验 取龙胆粉末按2.1.2项下方法制备供试品溶液6份，依次进样，记录峰面积，结果当药苷RSD = 0.87%，獐牙菜苦苷RSD = 1.30%。表明方法重现性良好。

2.2.5 加样回收率试验 取已知龙胆样品6份，精密称定，加入适量的当药苷、獐牙菜苦苷对照品溶液，按2.1.2项下方法制备，测定当药苷、獐牙菜苦苷的含量，计算回收率，结果当药苷平均回收率为96.63%，RSD值为1.21%；獐牙菜苦苷回收率为97.40%，RSD值为1.31%。见表3，表4。

2.3 样品含量测定 分别取不同地区、不同部位的龙胆药材粉末，按上述供试品溶液的制备方法和色谱条件测定当药苷、獐牙菜苦苷的含量，结果见表5。

2.4 指纹图谱

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Innoval C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（C），（0～11 min，2% C→5% C；11～30 min，5% C → 20% C；30～ 65 min ，20% C → 80% C；65～65.01 min，80% C→2% C；65.01～80 min， 2% C）梯度洗脱。流速：0.8 mL/min；检测波长：240 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 µL。

表3 当药苷的加样回收率（n = 6）

表4 獐牙菜苦苷的加样回收率（n = 6）

表5 龙胆中当药苷及獐牙菜苦苷含量测定结果

2.4.2 供试品溶液制备 同2.1.2项下供试品溶液制备。

2.4.3 不同产地龙胆根部及茎叶药材指纹图谱的建立 使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对不同产地龙胆根的指纹图谱进行分析，得到每个产地的对照谱图，见图2（插页二）。

2.4.4 相似度分析 使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对8批不同产地龙胆根对照图谱数据进行分析，以R为参考谱图计算相似度，计算每个产地8批样品间的相似度，不同产地龙胆根部指纹图谱，其相似度值均大于0.85，以每个产地的对照谱图作为该产地龙胆药材根部的特征指纹图谱。不同产地龙胆药材根部指纹图谱与对照指纹图谱的相似度在0.855～0.976之间，相似度较好，其中吉林省白山市靖宇县与对照图谱间的相似度最低，为0.855，其余7个产地均在0.880以上，表明吉林省白山市靖宇县较吉林省其他7个地区具有一定特殊性。另外，8个产地之间相似度均在0.681～0.986之间波动，表明吉林省内不同产地的龙胆药材根部的HPLC指纹图谱具有一定差异。这可能与药材的产地及年份有关。结果见表6。

2.4.5 系统聚类分析 指纹图谱反映了药材中大部分成分的信息，不同产地龙胆药材根部指纹图谱共有峰的峰面积，见表7。将其共有峰总面积通过SPSS 21.0统计软件进行聚类分析，结果见图3（插页二）。

3 小结

3.1 色谱条件分离 本文通过查阅相关文献[12-18]，以乙腈-水-醋酸（10：105：1）为流动相，当药苷及獐牙菜苦苷成分未完全分离，出现峰拖尾现象，且压力线不稳定，经反复测定，发现与酸度有关。后改变流动相，以甲醇-水（20：80）为色谱条件，当药苷及獐牙菜苦苷完全分离。

3.2 不同产地龙胆根及根茎中当药苷及獐牙菜苦苷含量与生态环境的相关性 不同产地龙胆根及根茎中当药苷及獐牙菜苦苷含量的高低与其生态环境有一定的关系，獐牙菜苦苷、当药苷在茎叶中含量较低，远低于根及根茎中的含量；茎叶中几乎未检测到当药苷的含量；花中未检测到当药苷、獐牙菜苦苷的含量。

表6 8批样品根部指纹图谱的相似度

表7 不同产地样品指纹图谱的共有峰面积

3.3 指纹图谱与聚类分析 指纹图谱与聚类分析是现代分析统计常用的手段之一，能够较充分的提取物质独特的信息。二者的结合为龙胆的产地识别及质量评价提供了新的思路和模式[19-20]。

不同产地的龙胆HPLC指纹图谱与对照图谱间的相似度均在0.855以上，说明该指纹图谱可以代表吉林省内各产地龙胆药材的鉴别特征。

从图3可知，吉林省不同产地龙胆药材所含各种有效成分分类基本相同，但含量上有一定差别，8个产地中七星百草园指纹图谱共有峰总面积最高，吉林市江密峰镇次之。聚类分析结果显示，随着阈值的增大，8个产地样品大致可以分为两大类，七星百草园、吉林市江密峰镇、长春市九台区、吉林市龙潭区杨木乡与吉林市昌邑区左家镇为一类，吉林省永吉县、吉林省蛟河天岗镇与吉林省白山市靖宇县为一类。前5个产地又可分为两类，其中七星百草园单独为一类，吉林市江密峰镇、长春市九台区、吉林市龙潭区杨木乡与吉林市昌邑区左家镇为一类；后3个产地也可分为两类，吉林省永吉县单独一类，吉林省蛟河天岗镇与吉林省白山市靖宇县为一类。