背部推拿法对亚急性衰老并免疫功能低下家兔局部皮肤与脑组织IL-33表达的影响

张 欣 ，崔 建，刘明军 ，王之虹 ，卓 越，陈邵涛，仲崇文，尚 坤

（1.长春中医药大学针灸推拿学院，长春 130117；2.长春中医药大学附属传统诊疗医院，长春 130022；3.长春中医药大学基础医学院，长春 130117）

背部推拿法是项目组结合多年临床实践经验总结而成的特色推拿疗法，对于改善亚健康状态、慢性疲劳综合征等免疫功能低下的一系列症状具有良好的作用[1]。白介素-33（IL-33）作为多功能细胞因子，参与调节Th2型机体免疫和炎症反应，被认为是Th2型免疫反应的关键活化因子[2-3]。因此，项目组以国家自然科学基金项目的前期研究成果为基础，通过检测背部推拿法干预后的亚急性衰老并免疫功能低下家兔模型局部皮肤组织和脑组织中IL-33蛋白表达情况，初步探讨背部推拿法对机体免疫功能的调节作用机制。

1 材料

1.1 动物 4月龄纯种新西兰大耳家兔，28只，由长春中医药大学实验动物中心提供，体质量（1 947±232）g。按随机数字表法分为4组，空白组、模型组、推拿组和药物组，每组7只。

1.2 药品与仪器 D -半乳糖（成都溶海生物技术有限公司）；黄芪精口服液（江苏南星药业有限公司）；IL-33一抗（美国Santa 公司）；RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）；Realtime PCR仪（美国BIO-RAD公司）；恒温离心机（法国Jouan公司）；光学显微镜及图像分析系统（德国Leica公司）。

2 方法

2.1 造模 采用腹腔注射D -半乳糖的方法制造亚急性衰老动物模型。使用浓度为0.9 %的生理盐水配制D -半乳糖溶液，浓度为1.25%。以50 mg/（kg·d）标准换算注射剂量，腹腔注射1次/d，连续操作6周。空白组实验动物采用等量生理盐水腹腔注射。推拿组和药物组在造模结束后的第2天即开展相应治疗，治疗时注意家兔不做固定处理。空白组动物每天抓取1次，不做其他处理。

2.2 治疗方法

2.2.1 推拿治疗 1）治疗部位：足太阳膀胱经背部第一侧线，自肺俞穴至肾俞穴段（穴位选取按《实验针灸学》[4]定位）。2）操作方法：①按揉法。将食指和中指分别放置于实验动物背部两侧足太阳膀胱经第一侧线上，以指腹部贴紧治疗部位，从头颈部至尾部方向施以按揉法操作，操作力量约为0.5 kg，操作时间3 min；②推脊法。将食指和中指分别放置于实验动物背部两侧足太阳膀胱经第一侧线上，以指腹部贴紧治疗部位，从头颈部至尾部方向施以按揉法操作，操作力量约为0.5 kg，操作时间3 min；③捏脊法：双手食中指在前，拇指在后，以指端捏拿住操作部位的皮毛及皮下组织施以捏脊法，操作力量适中，操作方向从尾部至头颈部，反复操作10遍。以上手法操作力量均经由推拿手法测试仪测定。操作1次/d，10 min/次，连续操作21 d。

2.2.2 药物治疗 黄芪精口服液（江苏南星药业有限公司生产，批号：国药准字Z32021206）。口饲，30 g/kg。1次/d，连续口饲21 d。

2.3 观察指标及方法 观察指标：施术部位皮肤与脑组织中IL-33蛋白表达情况。检测方法：治疗结束后，处死实验动物，采集施术部位的局部皮肤和部分脑组织，采用实时荧光定量PCR法等检测局部组织中IL-33蛋白的表达情况。

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件包进行t检验和单因素方差分析。数据结果以均数±标准差（x± s ）表示。P＜0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 各组家兔局部皮肤IL-33蛋白表达比较 见表1，图1（插页二）。

3.2 各组家兔脑组织IL-33蛋白表达比较 见表2，图2（插页二）。

表1 各组家兔局部皮肤IL-33蛋白表达比较（± s ，n = 7） 平均光密度值

表1 各组家兔局部皮肤IL-33蛋白表达比较（± s ，n = 7） 平均光密度值

注：与空白组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别 IL-33

表2 各组家兔脑组织IL-33蛋白表达比较（x± s ，n = 7） 平均光密度值

4 讨论

中医认为，“正气存内，邪不可干”，人体的“正气”，即相当于现代医学所说的免疫功能。人体十二经脉中的足太阳膀胱经，起于头面部，止于足部，在所有经脉中走行路线最长，分布最广；且“太阳主人体一身之表”，被认为是人体的藩篱；太阳为诸阳之首，太阳经在三阳经中阳气最盛。因此，刺激足太阳膀胱经，能够有效改善人体正气盛衰的状况，同时，足太阳膀胱经的背部循行路线上分布着背俞穴，是人体脏腑经气输注于体表的特定穴位，能够有效培补人体正气，调节五脏六腑功能。文献研究[5-8]也表明，推拿疗法能够有效调整机体的免疫功能。

现代医学研究[9-11]表明，衰老最明显的特质之一是免疫功能的减退。随着人体的衰老，各免疫器官、免疫细胞、免疫分子的功能也日渐衰退[12-15]。因此，项目组通过制造亚急性衰老动物模型的方法来制造免疫功能低下动物模型。

白细胞介素33（IL-33）是SCHMITZ J等[16]2005年在分析小鼠和人类基因组序列时发现的。随后的研究[17]表明，IL-33是免疫反应的一种潜在诱导物，能够在机体发生感染、炎症的时候激活淋巴细胞、嗜碱性粒细胞以及肥大细胞，使之产生类细胞因子，从而发挥着十分重要的免疫促进作用。IL-33通过结合ST-2发挥生物学效应，通常被称为IL-33/ST2信号通路或IL-33/ST2轴[18]。大量的实验研究[19-20]证实，在机体发现病原微生物以及激发免疫应答的过程中，IL-33/ST2信号通路起着重要的作用，是机体免疫功能调节的重要标志物之一。

通过表1和图1可见，背部推拿法与口服药物法均能够有效提高家兔局部皮肤中IL-33含量，且推拿法对于IL-33含量的增加作用略优于口服药物法。通过表2和图2可见，背部推拿法与口服药物法均能够有效提高家兔脑组织中IL-33含量。IL-33做为Th2型免疫反应的关键活化因子，同时在背部推拿法干预的家兔模型局部皮肤组织和脑组织中表达增强，说明背部推拿法调节机体免疫功能可能是通过提高机体IL-33含量来实现的。

本研究结果表明，背部推拿法调节机体局部免疫功能的可能机制之一是通过提高机体局部组织与脑组织IL-33含量来实现免疫调节功能的。相信本研究成果将为背部推拿法作用机制的研究提供了实验室证据和新的研究思路，也为背部推拿法的临床应用起到推动作用。