针刺对心衰模型大鼠血浆中精氨酸加压素浓度及水通道蛋白2表达的影响

治丁铭，孙 聪

（长春中医药大学，长春 130117）

心力衰竭的发病率在全世界呈上升趋势，现代学者在解决各种心血管病变后，发现心力衰竭是目前世界上最难以攻克的问题之一[1]。心力衰竭严重影响人们的生命健康及生活质量，成为亟待解决的问题。针刺不良反应及毒副作用小，操作简便，节省药材，并可配合其他疗法提高疗效和缩短疗程[2]。本实验旨在观察针刺对心衰模型大鼠血浆中精氨酸加压素（AVP）浓度及水通道蛋白2（AQP2）表达的影响，并探讨其可能的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康Wistar大鼠60只，180～220 g，购自吉林大学实验动物中心。

1.1.2 试剂与仪器 SYBRGreen PCR 试剂盒（ABI公司）；Real-time PCR 检测仪（ABI-7300 ABI美国）；PCR扩增仪；华佗牌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）。

1.2 模型复制 采用阿霉素诱导及睡眠剥夺的方式造模[3]。阿霉素按3 mg/kg的剂量溶于1 mL生理盐水中，腹腔注射，每周1次，共6周，同时对大鼠进行睡眠剥夺（即连续5 d，每30 min闹钟响铃1次），正常对照组注射等体积生理盐水，共6周，6周后通过观察模型组大鼠的心衰症状（即活动量、食欲、紫绀、水肿、尿量）和左室舒张末压≥15 mmHg为心衰造模成功的主要指标。

1.3 分组 将造模成功的实验性心衰大鼠，随即分为模型组、对照组、针刺治疗组，共3组。

1.4 针刺方法 对照组、模型组分别灌胃10 mL/kg蒸馏水，连续灌胃1个月。治疗组参照《实验针灸学》[4]选择双侧心俞穴、双侧肾俞穴、双侧内关穴针刺，1次/d，20 min/次。10 d为1个疗程。

1.5 标本采集 灌胃4周后，将大鼠断头处死，腹部正中切口，切开皮肤、肌肉、筋膜、腹膜，将肾组织周围内脏推向两侧，迅速取近髓肾组织，切半，一半浸泡在10%甲醛中固定48 h备用；一半置于- 80 ℃冰箱中备用。

1.6 大鼠水通道蛋白2（AQP2）mRNA表达的影响 通过组织总RNA提取、逆转录cDNA，将制备好的cDNA进行PCR扩展，然后分别取PCR扩展产物10 µL在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳终止后，用凝胶成像系统进行扫描、拍照，采用仪器自带软件（ABI Prism 7500 SDS Software）分析产物CT值，计算∆CT值，并以GAPDH内参照CT值进行标准校正，并通过软件计算PCR产物的相对表达量。

1.7 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计算资料用均数±标准差（x± s ）表示，组间比较用t检验，多组间用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对各组大鼠血浆AVP 浓度的影响 见表1。

2.2 对各组大鼠水通道蛋白2（AQP2）表达的影响 见表2，图1（插页一）。

2.3 水通道蛋白2（AQP2）在大鼠肾组织的表达量变化 见图2（插页一）。

表1 对各组大鼠血浆AVP 浓度的影响（x ± s ，n = 20） μg/L

表2 对各组大鼠水通道蛋白2（AQP2）蛋白表达的影响（x± s ，n = 20）

3 讨论

心力衰竭的发病因素多而复杂，其主要包括人口老龄化，不良的生活习惯，各种心血管疾病的不良预后，例如高血压病、动脉硬化、房颤等均可引起心力衰竭的发生，可以说心力衰竭是一切心血管疾病发生、发展的终末阶段，是心血管事件链的最终结局[5-8]。心力衰竭是一种复杂的临床综合征，同时伴有神经内分泌异常激活以及心肌重构等分子机制异常，结果导致了衰竭的心脏出现进展性恶化，为各种心脏病的末期表现，伴有耐力、体力差、水肿、衰竭和寿命缩短，因其病人多伴有水肿、胸水、腹水等，故也属于水液潴留性疾病之一[9-12]。心力衰竭水潴留机制的主要途径为心输血量下降，血管加压素水平升高，肾脏集合管V2受体激活，水通道蛋白（AQP2）激活和（或）基因表达上调，水重吸收增加。AQP2主要受精氨酸加压素（AVP）调控，而AVP通过肾脏V2受体调控AQP2，故AVP-V2受体-AQP2系统在调节机体水液代谢中起着重要作用[13-15]。

目前，大部分中医学者将心力衰竭的病因病机分为内因和外因，主要包括饮食不节，脏腑虚衰，气滞血瘀，水湿内停，痰浊闭阻等，认为心力衰竭病因复杂，属于虚实夹杂。现代医学认为，心力衰竭属于本虚标实之证，且病机复杂，因病程中传变五脏，故其症状和体征不完全相同，气虚必致阳虚，虚则不能推动血液运行，血行迟滞而成瘀，水津代谢异常而成痰（饮）、成水，瘀、痰、水结于体内，耗伤心气、损伤心体而致心衰，故“虚”“瘀”“水”可概括心力衰竭的病机。心俞、内关穴均为八脉交会穴，针剌心俞、内关穴能运行气血，调节阴阳，疏通经络，益气升提。现代医学研究认为，针剌内关穴对心率有双相调节作用。

本研究结果表明，在末次针刺后60 min，针刺治疗组与未治疗的模型组相比AVP浓度明显降低，并具有统计学意义（P＜0.01），针刺治疗组血浆中AVP浓度低于对照组，但无统计学意义（P＞0.05）。

采用免疫组化、蛋白印迹方法检测水通道蛋白2（AQP2）蛋白表达，免疫组化结果表明，对照组大鼠肾组织中AQP2蛋白呈阴性表达（-）；模型组大鼠肾组织中AQP2蛋白呈强阳性表达（+++）；针刺组大鼠肾组织中AQP2蛋白呈阳性表达（+）。蛋白印迹结果显示，各组灰度值进行对比。针刺组与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），模型组与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组心衰大鼠AQP2-mRNA表达明显升高，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；针刺治疗组与模型组比较AQP2-mRNA明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。