重金属污染土壤微生物的分离与研究

2018-10-20杨定清吴健英代晓航

山西农业科学 2018年10期

魏超，杨定清，吴健英，代晓航，向冰

（1.四川省农业科学院分析测试中心，四川成都610066；2.乐山市农业信息站，四川乐山614000）

土壤重金属污染是指人类活动使重金属进入到土壤，致使土壤中重金属含量明显高于背景值，并造成生态环境恶化的现象[1]。随着工业三废[2-3]和生活污水排放，矿山废弃[4-5]的与日俱增，土壤、水体的重金属污染日益严重。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，它不仅可以指示污染土壤的生态系统稳定性，而且还具有巨大的潜在环境修复功能[6]。现今重金属土壤改良大体有2种方法：理化方法和生物方法[7-8]，其中，生物方法多采用植物富集[9-10]，然后将植物去除达到减少土壤重金属的目的，此法的优点是有效去除重金属污染，但缺点是耕地闲置，无法有效利用资源，生物方法的另外一个方向是采用活性微生物的富集作用，竞争土壤中的重金属元素，再利用生物固氮的方法改变土壤的营养结构，达到改良土壤的作用[11]。可见，寻找到重金属污染土壤中土著富集重金属微生物是生物方法土壤修复的关键步骤。此外，特殊环境中的土著微生物为适应环境，具备特有的选择性进化，也是指示土壤污染程度的有效工具，对重金属污染土壤中微生物的种群研究十分必要。

本试验从不锈钢厂排污口附近土壤中分离耐高浓度重金属的微生物，对其进行鉴定和富集试验，旨在为微生物法土壤改良提供理论保障。

1 材料和方法

1.1 材料

取距不锈钢厂（乐山）排污口直径50 m、深度10 cm的样品土壤100 g，取3处不同的点。

营养琼脂培养基，营养肉汤培养基（广东环凯生物科技有限公司）；琼脂（美国sanland公司）。

1.2 试剂和仪器

甲酸（色谱纯），美国TEDIA公司；乙醇、乙腈（色谱纯），美国Fisher Scientific公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），美国SIGMA公司；MOS级硝酸，上海阿拉丁生化科技公司；氢氟酸、盐酸，成都科隆公司。试验用水为双蒸水。

原子吸收光谱仪（美国Varian公司，SpectrAA 220FS）；基质解析电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）（日本岛津公司，AXIMAConfidence）；生物安全柜（上海立申仪器设备有限公司，HF-safe-1200）；生物培养箱（宁波东南仪器有限公司，DHP-9082）。

1.3 土壤中重金属的测定

1.3.1 样品前处理准确称取0.10 g土壤样品于60 mL四氟乙烯坩埚中，加入5 mL盐酸，放置在电热板上低温加热，使样品初步分解，当样品蒸发至2 mL时，取下稍冷，然后加入10 mL硝酸、5 mL氢氟酸置于200℃恒温电热板上加热消解，样品消解完全，继续加热至白烟冒尽，当样品呈黏稠状时，用水冲洗，加2 mL硝酸温热溶解残渣，转移定容至10 mL待测。

1.3.2 仪器条件与回归方程采用火焰原子吸收法（FAAS）测定土壤中铅（Pb）、铬（Cr）、镍（Ni）、铜（Cu）、铁（Fe）、锌（Zn）含量，仪器条件：狭缝宽 0.5mm，燃气流速2.0 L/min，助燃气流速13.5 L/min，吸收波长如表1所示，用0.5%的硝酸逐级稀释单元素标准溶液，分别配制0.000，0.500，1.000，2.000，4.000mg/L的 Cu，Ni，Cr标准系列溶液；0.00，5.000，10.000，20.000，40.00μg/L的Pb标准系列溶液；0.000，0.500，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/L 的 Zn 标准系列溶液；0.000，2.000，4.000，8.000，16.000 mg/L 的 Fe标准系列溶液，在优化的仪器工作条件下测定吸光度并绘制工作曲线，工作曲线方程及相关系数列于表1。

表1 土壤重金属检测条件

1.4 微生物的分离

根据土壤中重金属的检测结果，设计高Fe选择性培养基：基础营养琼脂33.0 g/L，琼脂10.0 g/L，121℃灭菌15min，待培养基冷却至65℃时，添加过膜除菌 FeSO4·7H2O（1 g/mL）溶液 50 mL，倾注 15～20mL于90mm×90mm平皿冷凝待用；设计高Cr培养基：基础营养琼脂33.0g/L，121℃灭菌15min，待培养基冷却至65℃时，添加过膜除菌K2Cr2O7（1g/mL）溶液10 mL，倾注15～20 mL于90 mm×90 mm平皿冷凝待用；将土壤样品在无菌生理盐水中分别进行1∶10，1∶100，1∶1 000 稀释，取 0.3 mL 稀释液分别涂布于高Fe选择性培养平板和高Cr选择性培养平板，36℃培养24h，挑取单菌落用高Fe选择性培养平板和高Cr选择性培养平板经典纯化2次。

1.5 微生物的鉴定

纯化后微生物采用MALDI-TOFMS进行鉴定[12]。

前处理条件：移取适当菌量加入1.0mL70%乙醇水溶液，振荡30 s后离心1 min弃溶液，加入70%乙酸水溶液0.75 mL振荡20 s，25℃，40 kHz超声10 min，加入0.75 mL乙腈振荡均匀，4 000 r/min离心 1 min，取上清液 1 μL点至靶板，挥干，加入 1 μL CHCA，挥干。

质谱条件：检测器线性模式-电子倍增管（multiple dynode），电喷雾离子源（ESI），氮气激光器，固定聚焦337 nm，激光束能频75～80 Hz，收集范围2 000～20 000（m/z），每样品100次收集峰叠加，ATCC8739大肠杆菌为校准品。

1.6 微生物在重金属液体培养基生长研究

高Fe液体培养基：营养肉汤培养基18 g/L，121℃灭菌15min，待培养基冷却至65℃时，添加过膜除菌 FeSO4·7H2O（1 g/mL）溶液 50 mL；高 Cr液体培养基：营养肉汤培养基18g/L，121℃灭菌15min，待培养基冷却至65℃时，添加过膜除菌K2Cr2O7（1g/mL）溶液10 mL，将微生物接种在液体培养基后在0，4，8，18，24，26，42，48，50，70h，取 1mL 菌液经稀释涂布营养琼脂进行微生物计数，并将获得结果采用ComBase软件进行拟合，可获得微生物在重金属培养溶液中的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 土壤重金属检测

由表2可知，3份土壤中重金属铁的含量非常高，T6064样品的铁含量最高，可达2.0×105mg/kg，铬也远高于一般土壤，属于重金属严重污染土壤，3份土壤中每种重金属含量都有一定的差异，这和取样位置有关。

2.2 微生物的分离与鉴定

因为土壤中铁的含量较高，固体培养基在金属盐十分高的情况下无法凝结，所以，分离培养基设计中降低了Fe盐比率并额外添加了琼脂，设计高Fe选择性培养基中共分离出微生物1株，经质谱鉴定为希瓦氏菌（Shewanella sp.），鉴定图谱如图1所示；在设计高Cr选择性培养基中共分离到微生物1株，经鉴定为短小芽孢菌（Bacillus pumilus），鉴定图谱如图2所示。

2.3 希瓦氏菌在Fe盐培养基的生长状况

希瓦氏菌在Fe盐培养基的生长点拟合生长曲线如图3所示，点状图是实测微生物浓度的对数值，拟合生长曲线无延滞期的Baranyi and Roberts模型[13]如公式（1），（2），符合微生物正常生长状态。试验表明，分离希瓦氏菌在高铁液体培养基中可耐受并且生长良好。有研究表明，部分希瓦氏菌种营养方式为能自养通过氧化Fe2+获得自身生长的能量，可用作浸矿菌种[14-17]，本试验中分离的希瓦氏菌（Shewanella sp.）可在高浓度铁盐中生长，具有一定的开发意义。

式中，t为时间（h）；Y（t）为 t时的菌数（cfu/g）；Y0为初始菌数（cfu/g）；Ymax为最大菌数（cfu/g）；μmax为最大比生长速率；h0为模型的参数。

2.4 短小芽孢菌在Cr盐培养基的生长状况

短小芽孢菌在Cr盐培养基的生长点拟合生长曲线如图4所示，点状图是实测微生物浓度的对数值，线状图为芽孢菌在培养基中生长曲线（有延滞期的Baranyi and Roberts模型），但分离短小芽孢菌在富Cr盐培养基中生长一段时间后微生物数目减少。试验结果表明，分离短小芽孢菌在高铬液体培养基中可耐受，但生长状态受到一定的影响。此外，营养琼脂培养2种微生物2代后在富重金属液体培养基中不耐受。有研究表明，芽孢杆菌科中某些种，如地衣芽孢杆菌具有吸附重金属Cr的作用，可用于水体净化[18-20]，本试验在不锈钢厂废水污泥中收集的短小芽孢杆菌可耐受高Cr盐培养基，但生长状况不符合微生物生长规律，此微生物开发和利用还需要进一步的强化。