HPLC—双波长法同时测定苗药了哥王乙醇提取物中伞形花内酯和西瑞香素的含量

冯果 李玮 何新 吴增光 郑传奇

中图分类号 R917；R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）17-2369-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.15

摘 要 目的：建立同时测定苗药了哥王乙醇提取物中伞形花内酯和西瑞香素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Diamonsil C18，流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为0～15 min，324 nm，>15～45 min，346 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 ?L。结果：伞形花内酯和西瑞香素的检测进样量线性范围分别为0.33～6.60 μg（r=0.999 7）、0.21～4.20 μg（r=0.999 2）；检测限分别为6.60、4.20 ng，定量限分别为18.90、12.60 ng；精密度、稳定性（48 h）、重复性试验的RSD<2%（n=6或n=7）；平均加样回收率分别为98.27%、99.98%，RSD分别为1.96%、1.84%（n=9）。结论：该方法操作简单、结果准确、稳定性和重复性好，适用于苗药了哥王中伞形花内酯和西瑞香素含量的同时测定。

关键词 了哥王；苗药；高效液相色谱法；伞形花内酯；西瑞香素；含量测定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of umbelliferone and daphnoretin in ethanol extract of Miao medicine Wikstroemia indica simultaneously. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 324 nm during 0-15 min and 346 nm during >15-45 min. The column temperature was 30 ℃， and injection volume was 20 μL. RESULTS： The linear range was 0.33-6.60 μg for umbelliferone （r=0.999 7） and 0.21-4.20 μg for daphnoretin （r=0.999 2）. The detection limits were 6.60 and 4.20 ng， and the limits of quantification were 18.90 and 12.60 ng， respectively； RSDs of precision， stability （48 h） and reproducibility tests were lower than 2% （n=6 or n=7）. The average recoveries were 98.27% （RSD=1.96%， n=9） and 99.98% （RSD=1.84%，n=9）， respectively. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， stable and reproducible. It is suitable for content determination of umbelliferone and daphnoretin in Miao medicine W. indica simultaneously.

KEYWORDS Wikstroemia indica； Miao medicine； HPLC； Umbelliferone； Daphnoretin； Content determination

了哥王[Wikstroemia indica（L.）C. A.Mey.]為瑞香科荛花属植物[1]，为南方常用苗药，其性寒、味苦、辛、微温，有大毒，归肺、肝经，具有清热解毒、消肿散结、止痛等功效。目前，从了哥王中分离得到的80多种化合物可分为香豆素类、木脂素类、黄酮类、蒽醌类、甾族类、皂苷类、萜类、酰胺类、多糖类和挥发油等10大类[2-14]。此外，了哥王中还含有大量的酯类、酮类、烯类、醇类等化合物。了哥王具有抗菌、抗炎镇痛、抗病毒、抗肿瘤、抗疟、利尿、引产、镇咳祛痰、降低心肌耗氧量等药理作用[15-20]，临床广泛用于呼吸系统、泌尿系统、皮肤等急性扁桃体炎、慢性支气管炎、急慢性感染性炎症、颈淋巴结肿大、乳腺炎、肝炎、肝硬化、肝腹水、肢体疼痛、带状疱疹、皮下剥离伤、坐骨神经痛和多种癌症如乳腺癌、恶性淋巴癌、肺癌及各种体表癌等[21]。伞形花内酯和西瑞香素为苗药了哥王香豆素类主要有效成分。本研究采用高效液相色谱（HPLC）-双波长法建立了同时测定苗药了哥王乙醇提取物中伞形花内酯和西瑞香素含量的方法，以期为苗药了哥王中伞形花内酯和西瑞香素的含量测定及完善了哥王药材质量控制标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260 HPLC仪，包括 G1311B四元泵、内置真空脱气机、G1329B标准自动进样器、G1315D二极管阵列检测器、G1316A 柱温箱、ChemStation 色谱工作站（美国 Agilent 公司）；XL-10B粉碎机（浙江大鹏机械有限公司）；LT1002E电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）；SLG-1000渗漉提取罐（北京仪器厂）；RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FA2004电子分析天平（上海衡平仪器仪表厂）； HH-S4恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；KQ-3200DA数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

了哥王药材采购于广西各中药材市场，共10批，经贵阳中医学院药学院李玮教授鉴定为瑞香科荛花属植物了哥王[Wikstroemia indica（L.）C. A.Mey.]，使用时取药材粉碎成粗粉（过1号筛），备用；了哥王药材来源详见表1。伞形花内酯对照品（批号：BW5534，纯度：>98%）购自北京坛墨质检科技有限公司；西瑞香素对照品（批号：111758，纯度：>98%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） ；检测器：紫外检测器；波长：0～15 min，324 nm，>15～45 min，346 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 ?L；流动相：乙腈（A相）-0.2%磷酸溶液（B相），梯度洗脱（0～5 min，22%～25%A；5～15 min，25%～25%A；15～20 min，25%～30%A；20～25 min，30%～33%A；25～30 min，33～30%A；30～35 min，30%～28%A；35～40 min，28%～25%A；40～45 min，25%～22%A）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取伞形花内酯、西瑞香素对照品33.00、21.00 mg，分别置于 50 mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.66、0.420 mg/mL的对照品贮备液，4 ℃保存，备用。

分别精密吸取伞形花内酯、西瑞香素对照品贮备液 25.0 mL，置于同一 50 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.330、0.210 mg/mL的混合对照品溶液，4 ℃保存，备用。

2.2.2 供试品溶液 精密称取了哥王乙醇渗漉法提取物粉末（以下简称“乙醇提取物”）[22]約0.5 g，精密称定，置于具塞三角烧瓶中，加80%甲醇30 mL超声（功率：200 W，频率：40 kHz ）提取30 min，过滤，挥干滤液，残渣用甲醇溶解，溶液转移至10 mL的量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 空白溶液 取流动相作为空白溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。结果，在该色谱条件下，伞形花内酯和西瑞香素之间及与其他成分达到较好的分离，分离度大于1.5。供试品溶液和混合对照品溶液的伞形花内酯、西瑞香素分别在9.0、35.5 min左右出现，理论板数以伞形花内酯计不低于3 000，详见图1。

2.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL分别至10 mL的量瓶中，甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液，即得。分别吸取20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得伞形花内酯、西瑞香素回归方程分别为y=57.086x+37.736（r=0.999 7）、y=41.162x+2.962 8（r=0.999 2）。结果表明，伞形花内酯、西瑞香素进样量分别在0.33～6.60 μg、0.21～4.20 μg范围内线性关系良好。

2.5 检测限与定量限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为3 ∶ 1时，得检测限；当信噪比为10 ∶ 1时，得定量限。结果，伞形花内酯和西瑞香素的检测限分别为6.60、4.20 ng，定量限分别为18.90、12.60 ng。

2.6 精密度试验

取混合对照品溶液（伞形花内酯、西瑞香素对照品质量浓度分别为0.330、0.210 mg/mL） 适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，伞形花内酯和西瑞香素峰面积的RSD分别为1.73%、1.51%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取了哥王乙醇提取物粉末（批号：20160304）供试品溶液适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24、48 h，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。结果，伞形花内酯、西瑞香素峰面积的RSD分别为1.30%、0.74%（n=7），表明供试品溶液室温下放置48 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

精密称取了哥王乙醇提取物粉末（批号：20160304）0.5 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共 6 份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，伞形花内酯、西瑞香素平均质量分数分别为0.751、43.62 mg/g（n=6），RSD分别为1.25%、0.73% （n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的了哥王乙醇提取物粉末（批号：20160304，含伞形花内酯、西瑞香素平均质量分数分别为0.751、43.62 mg/g）约0.10 g，共9份，分别加入相当于了哥王乙醇提取物原有含量的 80%、100%和 120% 对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果详见表2。

2.10 样品含量测定

取10批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果详见表3。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

笔者在前期试验中考察了回流提取法和超声提取法对样品中伞形花内酯和西瑞香素的提取量的影响。结果表明，回流提取法伞形花内酯和西瑞香素的提取量分别为0.750 2、43.587 5 mg/g，超声提取法伞形花内酯和西瑞香素的提取量分别为0.751 0、43.620 0 mg/g，两者间没有显著差异，且超声提取法简单、方便，故确定超声提取法为样品提取方法。在前期试验中，笔者还对水、乙醇、甲醇和80%的甲醇等不同溶剂进行了考察，结果表明，采用80%甲醇为溶剂效果更好。

3.2 检测波长的选择

通过对伞形花内酯和西瑞香素进行紫外扫描，结果表明伞形花内酯和西瑞香素分别在324、346 nm波长处有最大吸收。在分析过程中笔者还发现，伞形花内酯的出峰时间要早于西瑞香素。为了既能同时检测这2个香豆素类成分，又不影响这2个成分的吸收强度，笔者选择在不同时间段内切换检测波长以同时检测这2个成分，即在0～15 min，检测波长为324 nm；15～45 min，检测波长为346 nm。

3.3 检测方法的选择

在研究过程中，笔者对检测方法的流动相也进行了优选，包括对不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸等流动相进行了考察。结果表明，当选用乙腈-0.2%磷酸为流动相时，峰和分离度较好。在该流动相条件下笔者还进行了等度和不同梯度洗脱试验，考察了流速为0.8、1.0 mL/min时对伞形花内酯和西瑞香素的出峰时间和分离效果的影响。结果表明，选择梯度洗脱、流速为1.0 mL/min时，伞形花内酯和西瑞香素的出峰时间和分离效果较好。

综上所述，HPLC-双波长法操作简单、结果准确、稳定性和重复性好，适用于苗药了哥王中伞形花内酯和西瑞香素含量的同时测定。

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（收稿日期：2018-04-07 修回日期：2018-07-11）

（编辑：余庆华）