乳酸菌发酵过程参数的研究

杨俊慧，马恒，满德恩，郭脉海，刘庆艾，马耀宏，史建国*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014；2.菱花集团有限公司，山东 济宁 272032)

凡是能利用葡萄糖或乳糖发酵产生乳酸的细菌统称为乳酸菌[1]，分为18个属，共有200多种[2]。乳酸菌不仅在理论研究上具有重要的学术价值，是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。研究乳酸菌发酵过程中乳酸[3]、葡萄糖以及细胞数量等各参数的变化情况，可以更好地了解乳酸菌的发酵代谢过程，有利于发酵过程的调控。以往研究多局限于利用传统手段控制过程参数，如通过分光光度计测量发酵过程中细胞生长曲线[4]，采用中和滴定法或比色法测定乳酸含量[5]等，对发酵过程中重要参数的变化规律缺乏深入便捷的测试方法。使用现代化在线控制系统实时监测乳酸菌发酵过程，可以为乳酸菌发酵研究以及实际生产过程中参数控制问题提供更加准确、便利的方法。

本文使用在线控制系统对乳酸菌发酵条件进行研究，通过KRH-BI0300型发酵罐控制系统、细胞密度监测系统、SHP8400PM过程气体质谱分析仪、生物传感分析仪等多种现代化发酵过程分析手段检测发酵过程参数，准确且方便、快捷地掌握乳酸菌发酵过程主要指标的变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

乳酸菌L1(山东省科学院生物传感器重点实验室保藏)。

1.1.2 培养基

(1)斜面培养基：MC培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)。

(2)种子培养基：MRS肉汤培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司)。

(3)发酵培养基：10.0 g/L葡萄糖(天津大茂化学试剂厂)；5.0 g/L酵母膏(国药集团化学试剂有限公司)；5.0 g/L蛋白胨(国药集团化学试剂有限公司)；2.0 g/L柠檬酸氢二铵(国药集团化学试剂有限公司);1 mL/L吐温80(国药集团化学试剂有限公司)；5.0 g/L乙酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；2.0 g/L磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司);0.58 g/L硫酸镁(国药集团化学试剂有限公司);0.25 g/L硫酸锰(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 实验仪器

KRH-BI0300型发酵罐(江苏科海生物工程设备有限公司)；SHP8400PM过程气体质谱分析仪(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；细胞密度监测系统(瑞士哈美顿博纳图斯股份公司)；SBA-40D生物传感分析仪(山东省科学院生物传感器重点实验室)；立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；SW-CJ-2FD双人单面垂直送风净化工作台(浙江苏净净化设备有限公司)；303A电热恒温培养箱(南通宏大实验仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 乳酸菌发酵实验

1.3.1.1 菌株培养及保藏

将乳酸菌菌株接种于新鲜斜面培养基中，25 ℃培养24 h，再次进行接种培养24 h，放入4 ℃冰箱保藏，每隔一个月活化一次[6]。

1.3.1.2 种子培养

将乳酸菌菌株按10%接种量接种于种子培养基中，培养箱25 ℃静置培养24 h。

1.3.1.3 发酵培养

将乳酸菌种子液按10%接种量接种于10 L发酵罐中，搅拌100 r/min，通气0.5 L/min, 25 ℃培养至发酵结束。

1.3.2 过程参数分析方法

1.3.2.1 乳酸菌生长曲线测定

在细胞密度监测系统中，使用Incyte活细胞密度电极检测乳酸菌生长过程中的活细胞数量变化情况。

1.3.2.2 发酵过程中pH测定

通过KRH-BIO3000发酵罐控制系统，使用pH电极检测发酵过程中的pH变化。

1.3.2.3 发酵过程中乳酸、葡萄糖质量浓度测定

每隔2 h取样，利用生物传感器测定[7]浸泡液中乳酸、葡萄糖的含量，测定时每次为25 μL,响应时间20 s，测定周期小于2 min,误差小于2%。样品不需脱色、分离纯化就可直接测定。

1.3.2.4 发酵尾气成分测定

通过SP8400PM过程气体质谱分析仪分析主要发酵尾气成分。

2 结果与讨论

发酵过程中乳酸菌的生长与乳酸的产生和葡萄糖的消耗密切相关，同时发酵过程中的pH、溶氧等参数对发酵过程也有重要影响。通过发酵在线控制系统实时检测发酵过程中的参数变化，对乳酸菌发酵调控具有重要意义。

2.1 乳酸菌生长曲线测定

在细胞密度监测系统中测乳酸菌活细胞数量,其发酵过程变化情况如图1所示。在交变电场中，活细胞相当于微小的电容，而死细胞或细胞碎片不能极化，形不成电容[8-9]。Incyte电极测量这些小容量电容器的电荷，并以介电常数显示(pF/cm)。4 h时活细胞介电常数达到最大值，为0.57 pF/cm，继续发酵，细胞数量逐渐减少，15 h后逐渐趋于平稳。

图1 乳酸菌活细胞数量变化曲线Fig.1 The profile of the amount changing of lactic acid bacteria living cells

2.2 发酵过程中的pH变化情况

发酵过程中的pH是一个综合性指标，pH通过影响代谢途径中酶的活性、细胞膜的渗透性以及培养基中营养物质分解利用等因素进而影响微生物的生长繁殖和代谢产物的积累[10]。发酵过程中pH变化情况如图2所示。发酵10 h时，乳酸菌生长产生乳酸使pH明显下降。16 h后pH逐步稳定，因为乳酸菌生长进入衰亡期，乳酸产量趋于平稳。

图2 发酵过程中pH变化曲线Fig 2 The profile of pH changing during fermentation

2.3 发酵过程中乳酸、葡萄糖质量浓度测定

乳酸菌发酵是一个消耗葡萄糖、生成乳酸的过程，乳酸菌发酵过程中的葡萄糖、乳酸变化情况见图3、图4。如图3所示，发酵0～10 h过程中，发酵液中葡萄糖浓度逐步降低，10 h后葡萄糖浓度基本趋于稳定。如图4所示，0～10 h乳酸浓度逐渐增加，10 h后基本趋于稳定。

图3 发酵过程中葡萄糖、乳酸变化曲线Fig.3 The profile of glucose and lactic acid changing during fermentation

图4 发酵过程中气体体积分数变化曲线Fig.4 The profile of gas volume fraction changing during fermentation

2.4 发酵尾气成分测定

罐内N2、O2、Ar、CO2等主要发酵尾气组成体积分数的变化反映了整个发酵过程物质的变化情况[11]。发酵过程中尾气变化情况如图4所示。CO2的释放在一定条件下与细胞量成正比，监测CO2的生成是跟踪生长活动的有效方法。O2是构成细胞本身及代谢产物的组分之一，菌体的生长和产物的代谢均需要大量的O2。同时监测发酵罐中N2及Ar体积分数的变化可以充分了解尾气中各种组成气体所占比例，N2、Ar并不参与代谢过程，测定已知流速的进气空气和尾气中的N2、Ar的体积分数并建立平衡方程，可以消除尾气流速误差带来的影响[12]。随着发酵的进行，罐内的气体成分逐渐变化，CO2体积分数在5 h时开始升高，在7 h达到峰值后开始下降，20 h后逐渐趋于平稳；O2体积分数在5 h时开始下降，10 h后趋于平稳；N2体积分数在5 h时减少至最低点后逐渐增加直至趋于平稳，主要是因为罐内CO2体积分数增多，总体积不变的情况下N2占总体积分数减少，N2与O2体积分数减少量与CO2体积分数增加量基本相同。惰性气体Ar的体积分数基本不变。

3 结论

在整个发酵过程中乳酸菌不断繁殖，4～5 h乳酸菌活细胞数量达到最大值，同时发酵罐内乳酸菌发酵产生的CO2体积分数也达到最大值，O2消耗导致罐内O2体积分数达到最低点。随着乳酸菌的生长繁殖，产物乳酸的增长时间与培养基中主要成分——葡萄糖的消耗时间基本吻合，说明乳酸菌利用葡萄糖代谢繁殖生成乳酸，乳酸浓度增加的同时引起发酵过程中的pH变化。分析检测乳酸菌发酵过程中的主要参数，可以准确且方便、快捷地掌握乳酸菌生长繁殖情况，为乳酸菌代谢调控及其大规模工业化生产提供条件。