富含脯氨酸蛋白11在胆囊癌组织中的表达及意义

苏宝威，白明辉，刘海潮

胆囊癌是指发生于胆囊体、底、颈及胆管的恶性肿瘤，是胆道系统常见的恶性程度较高的肿瘤，发病率在消化系统恶性肿瘤中高居第6位［1］。胆囊癌发病率地域差别大，且与人种有关，亚洲及拉美地区高发；近年来，我国胆囊癌的发病率呈增高趋势。胆囊癌恶性程度高，整体5年生存率＜5.0%，中位生存期＜6个月［2］。目前延长胆囊癌患者生存期的唯一有效方法是根治性切除［3］，但胆囊癌早期症状缺乏特异性，诊断时大多已是中晚期，只有＜25%可切除，且50%左右出现淋巴结转移［1］，预后极差［4-5］。因此能否早期诊断胆囊癌就尤为重要，近年来已有较多研究寻找胆囊癌的生物学标志物，期望能为早期诊断胆囊癌并改善其预后提供帮助［6］。富含脯氨酸蛋白11（proline-rich protein 11，PRR11）已被证实在多种肿瘤如肺癌、胃癌、胰腺癌及骨肉瘤等中发挥作用，且参与调节细胞周期进程［7］，但目前鲜见有PRR11与胆囊癌关系的研究。本研究试图分析胆囊中PRR11的表达情况以探讨其与胆囊癌发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 为郑州大学附属洛阳中心医院2014年10月—2017年10月手术切除的标本，经病理证实胆囊癌组58例，其中男28例，女30例，年龄32～84岁，中位年龄56.7岁。组织学类型分类：腺癌48例，鳞癌10例。Nevein分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期10例，Ⅳ期19例，Ⅴ期13例。病理分级：高分化癌14例，中分化癌21例，低分化癌23例。淋巴结转移38例，无淋巴结转移20例。所有标本纳入标准：胆囊癌患者均无肿瘤病史，术前未接受化疗、放疗及生物治疗等，其病历资料完整。随机选取同期慢性胆囊炎49例作为对照组。兔抗人PRR11单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，S-P试剂盒，磷酸盐缓冲液（PBS），DAB显色试剂盒和抗原修复液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。其他设备及试剂由郑州大学附属洛阳中心医院中心实验室及病理科提供。

1.2 免疫组化SP法染色 取所有标本的石蜡切片（4 μm厚），常规脱蜡水化，PBS洗涤5 min，修复抗原：枸橼酸盐缓冲液中煮沸2 min，7 min后自然冷却到室温，PBS清洗3次；3%H2O2室温下浸泡10 min，阻断内源性过氧化物酶，室温下孵育30 min，PBS洗涤3次；10%山羊血清封闭抗原90 min；加入兔抗人PRR11多克隆抗体4℃过夜；室温下复温30 min，PBS洗涤3次；加辣根过氧化物标记过的羊抗兔IgG（稀释度1∶500），37 ℃反应45 min，PBS洗涤3次；加入S-A-HRP工作液于湿盒中37℃反应40 min，PBS洗涤3次；DAB显色，PBS洗涤3次；苏木素复染2 min，PBS洗涤3次。梯度乙醇脱水透明后封片。用已知阳性标本作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 每张切片均由两位经验丰富的病理科医生采用双人盲法阅片读取结果。PRR11表达阳性细胞在胆囊癌中呈棕褐色或（和）棕黄色，主要定位于细胞质，采用阳性细胞计数与染色强度相结合的二级计分法对PRR11蛋白阳性表达结果进行判定［8］。着色强度为0级（无着色/-）计0分，1级（黄色/+）计1分，2级（棕黄色/++）计2分，3级（棕褐色/+++）计3分。阳性细胞百分比≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。总分由阳性细胞百分比及着色强度两项计分相乘所得，总分＜4分为阴性，总分≥4分为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件进行分析，计数资料组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义，3组间多重比较时P＜0.017为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PRR11在胆囊癌、癌旁组织及慢性胆囊炎组织中的表达 PRR11主要表达于细胞质中，阳性颗粒呈棕黄色或棕褐色分布，见图1。胆囊癌组织、癌旁组织和慢性胆囊炎组织中PRR11阳性表达率分别为55.2%（32/58）、25.9%（15/58）和4.1%（2/49），胆囊癌组织中PRR11阳性表达率高于癌旁组织、慢性胆囊炎组织，差异均有统计学意义（χ2分别为10.337、26.504，均P＜0.01）。

2.2 PRR11表达与胆囊癌临床病理指标之间的关系 不同年龄、性别、组织学类型分组胆囊癌患者癌组织中PRR11阳性表达率比较差异无统计学意义，临床分期Ⅲ～Ⅴ期组阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期组，病理分级中低分化组阳性表达率高于高分化组，有淋巴结转移组阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义，见表1。

Tab.1 Relationship between PRR11 expression and clinicopathological parameters of gallbladder carcinoma表1 PRR11表达与胆囊癌临床病理指标的关系 例（%）

3 讨论

Fig.1 Immunohistochemical detection of PRR11 expression(×200)图1 不同组织免疫组化检测PRR11的表达（×200）

PRR11基因是新发现的一种参与细胞周期调控、与肿瘤发生发展相关的基因，位于人染色体17q22，由9个内含子和10个外显子组成，翻译起始密码子位于第2个外显子，终止密码子位于最后1个外显子［9］，该基因与目前发现的肿瘤相关基因BRIP1、RPS6KB1、PPM1D 及 TRIM37等共同位于17q22区，其编码的蛋白分子质量为40 ku，含360个氨基酸，有1个二联核定位信号，1个锌指结构域和2个脯氨酸富集区域。目前认为，恶性肿瘤的生物学特征是肿瘤细胞的失控性生长，而其根本原因是细胞周期的调控紊乱［10］。研究表明，敲除PRR11可阻滞细胞周期在S期，PRR11下调表达也导致细胞阻滞在G2期，从而抑制细胞进入有丝分裂，阻滞细胞DNA的合成和有丝分裂的正常进行，使细胞周期发生紊乱［11］，因此推测PRR11在肿瘤的发生发展过程中有非常重要的作用。

本研究显示结果发现，58例胆囊癌组织中PRR11呈阳性表达的有32例，阳性率高达55.2%，明显高于其在癌旁组织（25.9%）和慢性胆囊炎组织（4.1%），Nevein分期Ⅲ～Ⅴ期组PRR11阳性表达率高于Ⅰ～Ⅱ期组，提示PRR11在胆囊癌的发生过程中起一定作用。PRR11在中低分化癌组织中的表达（65.9%）显著高于其在高分化癌组织中的表达（21.4%），推测PRR11促进了胆囊癌的恶性生物学行为。此外PRR11蛋白的阳性表达率在有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，提示其可能增强了胆囊癌的浸润侵袭能力。而PRR11在胆囊癌组织中的表达与胆囊癌患者的性别、年龄等无关；这与PRR11在肺癌和胰腺癌［11-12］中的表达一致。宋宗昌等［13］研究发现PRR11表达下调可以显著抑制胃癌HGC-27细胞的增殖和侵袭能力，并可导致其侵袭相关蛋白cyclinD1蛋白和基质金属蛋白酶（MMP）-2蛋白表达下降。张小军等［14］研究显示，通过下调人骨肉瘤细胞SaOS2中PRR11的表达，可使G0～G1期的细胞比例明显增大，而S期细胞比例明显减少，推测PRR11蛋白推动骨肉瘤细胞从S期向G2/M期转换，导致细胞异常增殖，联合张春东等［11］的研究可见PRR11对细胞周期的调控是多方面的。因此PRR11不仅对肿瘤的发生发展及细胞周期有影响，而且还可诱导肿瘤侵袭相关蛋白的表达，增强肿瘤细胞恶性生物学行为。另有研究提示敲除PRR11还可以使参与细胞周期、肿瘤形成和转移关键通路中的重要基因如RRM1、EPB41L3、CCNA1和MAP4K4等表达下调，共同影响肿瘤形成的过程［15］。当然影响胆囊癌的发生、发展、浸润及转移的因素非常复杂，影响细胞周期的因素也很多，PRR11只是其中之一。

综上所述，PRR11与胆囊癌的发生、发展及侵袭等密切相关，但PRR11对肿瘤调控的机制非常复杂，具体还需进一步研究。