万珂增强NK细胞对前列腺癌细胞杀伤作用的实验研究*

胡炜，刘丹，陈曲，王嵬

（辽宁省锦州市中心医院 肿瘤科，辽宁 锦州 121001）

人类的先天性免疫系统中，自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）为其重要组成部分，尤其在肿瘤免疫治疗中，更发挥了重要作用。NK细胞可以通过各种有效的杀伤机制，杀伤同系、同种或异种瘤细胞，包括释放穿孔素和颗粒酶、通过死亡受体调节肿瘤细胞的凋亡等[1-3]。NK细胞表面具有活化性受体和抑制性受体，两者间的平衡状态是其能否发挥细胞毒效应的决定因素[4]。抑制性受体主要是杀伤细胞免疫球蛋白样受体，可以特异性地与细胞表面的人白细胞抗原-I（human leucocyte antige-I，HLA-I）类分子结合，参与NK细胞的活化过程，抑制由活化性受体激发的细胞毒性作用。有研究证明，蛋白酶体抑制剂—万珂（化学名硼替佐米）通过促进T淋巴细胞和NK细胞上表达的死亡配体—肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）连接到死亡受体4（death receptors 4，DR4）和DR5，引起肿瘤细胞的凋亡[5]。然而在前列腺癌细胞中，万珂致敏NK细胞杀伤肿瘤是否也是通过肿瘤细胞的抑制性配体实现，还未见报道。本研究用2种激素依赖性和激素非依赖性前列腺癌细胞株LNCaP和DU145为模型，探讨万珂是否可以致敏NK细胞对肿瘤的作用及其作用机制。NK细胞。经Ficoll-Paque Plus密度梯度离心，吸取界面层的外周血单个核细胞，用预冷Reaction buffer将单个核细胞的浓度调整为1×108个/ml，加入生物素化的抗体，混匀，孵育15 min，在混悬液中加入50μl磁珠，再次混匀，继续孵育15 min，将对细胞混悬液进行洗涤。将洗涤后的混悬液转移至磁场中，带磁力的细胞移至磁场中，6 min后吸除上清液，剩余NK细胞。将剩余的NK细胞在含10%胎牛血清和500 u/ml重组人白介素-2的RPMI 1640培养基中培养24 h，活化NK细胞。采用FITC-CD3和PE-CD56鼠抗人单抗标记NK细胞，用流式细胞仪分析CD3-CD56+细胞百分比以检测NK的纯度。本实验纯化的细胞中NK细胞＞85%。

1 材料与方法

1.1 材料

万珂（美国Millennium Pharmaceuticals公司），NK分离试剂盒（美国RD公司RPMI 1640，胎牛血清（天津灏洋生物有限公司），胰蛋白酶（美国HyClone公司），荧光标记抗体藻红蛋白（Phycoerethrin，PE）标记的抗人DR5抗体、抗人Fas抗体、抗人HLAABC抗体购自美国Biolegend公司，Trizol试剂（美国Invitrogen公司），实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）试剂盒（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 DU145、LNCaP细胞培养使用RPMI 1640培养基，培养基中含10%胎牛血清，2种细胞呈单层贴壁生长，用胰酶进行消化传代，待细胞呈对数生长时可进行实验。经各种因素处理后可进行指标检测。

1.2.2 NK细胞的分离及鉴定 取健康志愿者抗凝外周血20 ml，按NK细胞分离试剂盒说明书操作，分离

1.2.3 Annexin-V/PI法 20 nmol/L万珂处理DU145和LNCaP细胞48 h，记数细胞后，在每孔种植相同数量的细胞，细胞贴壁24 h。NK细胞以1∶1效靶比与肿瘤细胞共孵育6 d。收集所有细胞，用Annexin-V/PI法测定细胞的凋亡率。

1.2.4 流式细胞仪 取对数期生长的DU145、LNCaP细胞，不同浓度（0、10和20 nmol/L）万珂处理2种前列腺癌细胞株24 h，分别收集各组DU145、LNCaP细胞，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2次，调整细胞浓度为2×10个5/ml，取500μl细胞悬液，加入PE标记的HLA-ABC抗体20μl，避光孵育20 min。冷PBS洗细胞1次，将细胞重悬于0.5 ml PBS中，流式细胞仪检测肿瘤细胞表面HLA-ABC蛋白的表达。使用WinMDI软件进行数据分析。

1.2.5 qRT-PCR 取对数期生长的DU145、LNCaP细胞，不同浓度（0、10和20 nmol/L）万珂处理2种前列腺癌细胞株24 h，分别收集各组DU145、LNCaP细胞。采用Trizol法抽提细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，选用OD260/OD280比值为1.8～2.0的RNA标本用于下一步反应。按照逆转录试剂盒说明书进行操作，合成cDNA后进行PCR反应。分别向PCR管中加入SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5μl，cDNA 模 板 2μl，ddH2O 8.5μl，以及正反向引物各 lμl。HLA-C 正向引物 ：5'-TCCTGGTTGTCCTAGCTGTC-3'，反向引物 ：5'-CAGGC-TTTACAAGTGATGAG3-'；甘油醛-3-磷酸脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）正向引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物：5'-GAAG-ATGGTGATGGGATTTC3-'。引物均由大连宝生生物工程公司有限公司合成。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共45个循环，60℃收集荧光5 s，99℃、1 min，50℃、1 min，以0.5℃/s的速度升温到99℃，对荧光进行连续监测做熔解曲线分析。采用qRT-PCR仪进行检测，以HLA-C与GADPH相对浓度比值反映目的基因mRNA的表达。用双标准曲线法对目的基因进行相对定量测定。实验结果重复3次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 11.5统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较用t检验，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较用Tukey-HSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 万珂提高前列腺癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性

2.1.1 DU145细胞 未处理组、万珂组、NK细胞组及其共同预处理组的DU145细胞凋亡率分别为（21.698±2.658）%、（34.945±2.245）%、（23.972±2.952）%和（41.831±2.965）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=36.240，P=0.000）。进一步两两比较，万珂、NK细胞共同预处理的DU145细胞凋亡率较仅万珂或NK细胞预处理高（P＜0.05）。见图1。

图1 万珂致敏NK细胞对DU145细胞凋亡的影响 （±s）

2.1.2 LNCaP细胞 未处理组、万珂组、NK细胞组及其共同预处理组的LNCaP细胞凋亡率分别为（23.663±2.204）%、（25.992±1.743）%、（29.729±2.581）%和（30.310±1.638）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=6.922，P=0.013）。进一步两两比较，万珂、NK细胞共同预处理组的LNCaP细胞凋亡率与万珂组、NK细胞组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。处理过的DU145细胞凋亡率比LNCaP细胞更高。提示NK细胞能有效提高激素非依赖性前列腺癌细胞凋亡率，且NK细胞与万珂的联合应用较单独应用凋亡率更高。见图2。

图2 万珂致敏NK细胞对LNCaP细胞凋亡的影响 （±s）

2.2 万珂对DU145细胞HLA-I类分子mRNA和蛋白表达的影响

2.2.1 HLA-C mRNA 0、10和20 nmol/L万珂处理后DU145细胞HLA-C mRNA相对表达量分别为（1.017±0.107）、（0.892±0.152） 和（0.753±0.116），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=6.256，P=0.034）。进一步两两比较，10 nmol/L万珂处理后DU145细胞HLA-C mRNA表达水平与0和20 nmol/L万珂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；20 nmol/L万珂处理后DU145细胞HLA-C mRNA表达水平较0 nmol/L万珂组下调（P＜0.05）。见图3。

图3 不同浓度万珂对DU145细胞HLA-C mRNA表达水平的影响 （±s）

2.2.2 HLA-ABC蛋白 0和20 nmol/L万珂处理后DU145细胞HLA-C-ABC蛋白相对表达量分别为（65.842±0.178）和（38.220±0.389），经t检验，差异有统计学意义（t=12531.758，P=0.000），20 nmol/L万珂处理后DU145细胞HLA-ABC蛋白表达水平较0 nmol/L万珂组下调。见图4。

图4 不同浓度万珂对DU145细胞HLA-ABC蛋白表达水平的影响

2.3 万珂对LNCap细胞HLA-I类分子mRNA和蛋白表达的影响

2.3.1 HLA-C mRNA 0、10和20 nmol/L万珂处理后LNCap细胞HLA-C mRNA相对表达量分别为（1.027±0.101）、（0.930±0.140） 和（0.861±0.130），经单因素方差分析，差异无统计学意义（F=1.345，P=0.329）。见图 5。

2.3.2 HLA-ABC蛋白 0、10和20 nmol/L万珂处理后LNCap细胞HLA-ABC蛋白相对表达量分别为（2.831±0.428）和（2.110±0.551），经t检验，差异无统计学意义（t=3.221，P=0.147）。见图6。

图5 不同浓度万珂对LNCaP细胞HLA-C mRNA表达的影响 （±s）

图6 不同浓度万珂对LNCaP细胞HLA-ABC蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，前列腺癌的发病率越来越高。激素依赖性的前列腺癌患者可以用去势方法治疗，而激素非依赖性的前列腺癌对激素抑制治疗和化疗无效，患者生存率非常低，所以急切期待着新的治疗模式产生。

蛋白酶体抑制作用引发的抗肿瘤凋亡活性的精确机制非常难分析，似乎是多因素的。26S蛋白酶体能对大量的细胞通路进行调节。有研究表明，蛋白酶体抑制参与活化核转录因子κB[6-7]，降低死亡区域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白的表达，增加DR5的表达，通过细胞内的凋亡通路活化Caspase-3[8-9]，累积前凋亡蛋白Bik等大范围的细胞效应。而NK细胞也有TRAIL和Fas配体，其可以在靶细胞中触发凋亡。

曾经有人假设成熟的NK细胞表达≥1种自体HLA-I类抑制性受体，特别是HLA-C和Bw4分子[10]。当抑制信号占主导时，HLA-I类抑制性受体能够保护健康细胞不被NK细胞破坏[11]。而在相对情况下，NK细胞能积极地溶解肿瘤细胞而不显示这些抑制性受体。自体HLA分子使NK细胞失活是恶性肿瘤细胞逃逸宿主NK细胞介导的免疫的一个潜在机制[12]。

在正常的环境中，前列腺癌细胞表达自体HLA分子，使自体的NK细胞失活，这可能是肿瘤免疫逃逸机制的一个重要环节。这也有助于解释在实体肿瘤的治疗中获得性输注自体NK细胞相对缺乏活性[13]。本研究结果表明，万珂处理DU145细胞会导致细胞表面表达的HLA-ABC蛋白和HLA-C mRNA降低。这证明万珂能够克服前列腺癌细胞对NK细胞的抑制，使获得性输注NK细胞的治疗更有效，从而使其应用更广。可是这些改变却没有在LNCaP细胞上出现。还有研究表明，残留的宿主淋巴细胞的有效排斥反应限制了NK细胞输注的持久性，这也减少了治疗的有效性。而万珂能够通过特异性清除有自体反应性的T淋巴细胞，从而潜在促进NK细胞的持久性[14]。这些效应证明，万珂增强NK细胞的抗肿瘤活性。

综上所述，万珂抑制肿瘤细胞上HLA-ABC的表达，从而促进NK细胞对靶细胞的识别和杀伤。而这种效应在激素非依赖性前列腺癌细胞上表现更明显，证明万珂能成为一种有效的药物，增强肿瘤免疫治疗的效果，尤其为激素非依赖性前列腺癌的生物治疗提供新希望。