同型半胱氨酸对FABP4启动子活性的影响*

熊建团 ，李旭生 ，杨安宁 ，杨松昊 ，邓梅 ，王磊 ，高源 ，李南 ，杨晓玲 ，贾月霞，姜怡邓

（1.宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学总医院 骨科，宁夏 银川750004；3.宁夏医科大学 基础医学院，宁夏 银川 750004）

脂肪型脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4, FABP4）属于脂肪酸结合蛋白大家族的重要成员，主要在脂肪组织中高度表达，在巨噬细胞中也有大量表达[1]。近年来研究表明，FABP4在肥胖和动脉粥样硬化的发生中发挥重要作用[2]。FABP4表达缺失可通过降低炎症因子在巨噬细胞中的表达，保护高血脂老鼠避免动脉粥样硬化的发生[3]。目前国内关于FABP4基因启动子的研究较少。同型半胱氨酸（Homocysteine, Hcy）是心脑血管疾病的独立危险因子，通过多种机制影响基因表达，参与疾病发生、发展[4]。本研究以人源FABP4基因为研究对象，成功克隆FABP4基因启动子，分析确定影响FABP4基因启动子活性的核心区域，为进一步开展功能研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要设备和试剂

L-Hcy和佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）（德国Sigma-Aldric公司），二氧化碳CO2培养箱HF90（上海力新仪器有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素、链霉素、PBS缓冲液、DMEM和RPMI 1640培养基购自美国HycLone公司，相差显微镜（日本尼康公司），荧光素酶检测仪器（美国普洛麦格公司），PrimeSTAR HS DNA polymera（大连宝生生物工程公司有限公司），限制性内切酶Xhol、Hind Ⅲ、T4 DNA快速连接酶、DNA Marker及转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司，DNA提取试剂盒、凝胶回收纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒及双荧光素酶检测试剂盒购自美国普洛麦格公司，质粒纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司），pGL3-Basic质粒、pRL-TK质粒由本实验室保存，HEK-293A细胞（四川大学华西医学院），实验中所用引物及测序由上海英俊生物有限公司完成。

1.2 启动子序列分析

根据GenBank中人FABP4基因的序列（GenBank：CR456903.1），查找启动子区2 000 bp区域，分别根据http：//fruitfly.org：9005/seq_tools/promoter.html、http：//www.urogene.org/methprimer/index1.html网站预测启动子结合序列和甲基化岛分布情况的结果。

1.3 FABP4基因启动子报告基因载体的构建

将人FABP4启动子初步分为4个片段，分别为 -500/-1、-1000/-1、-2000/-1、-2000/-1501， 利用Primer 5设计合成4对特异引物获得相应片段，并在5’端和3’端分别添加Xhol和Hind Ⅲ酶切位点，引物序列见附表。将目的片段从亚克隆载体上切割并回收，回收目的片段并与pGL3-Basic载体连接，利用双酶切方法筛选并测序鉴定。

附表 FABP4基因启动子片段引物设计

1.4 细胞培养

HEK-293A工具细胞使用DMEM培养基，THP-1单核细胞使用RPMI 1640培养液，均含12%胎牛血清。于37℃、5% CO2环境中静置培养。以500 nmol/L PMA培养液孵育THP-1单核细胞48 h，单核细胞即分化为巨噬细胞，然后给予不用浓度（0、50、100、200和500μmol/L）Hcy干预24 h后进行后续实验。

1.5 FABP4基因启动子活性分析

将细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%汇合时，采用LipofectamineTM3000转染细胞。转染DNA总量为2μg/孔，pGL3-FABP4不同大小片段质粒与海肾荧光素酶报告基因载体（pRL2TK）的比值为100∶1。将海肾荧光素酶报告基因载体作为内源参照，以消除由于转染效率及细胞活性等因素带来的差异。转染48 h后，按照Promega公司荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，进行荧光素酶活性检测。实验重复6次，每次3个平行实验，启动子相对活性以目的基因荧光与海肾荧光的比值（Fluc/Rluc）表示。

1.6 统计学方法

数据分析采用GraphPad Software 6.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，两两比较用SNK–q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FABP4基因核心启动子预测分析

通过BDGP生物信息学网站预测，发现在FABP4启动子区2 000 bp的范围内含有2个可能的核心启动子位点，并且得分均＞0.95（满分1.00分）。见图1。

图1 FABP4基因核心启动子预测分析

2.2 FABP4基因启动子区CpG岛生物学预测

通过Methprimer网站预测，笔者观察到在FABP4启动子区2 000 bp范围内没有CpG岛的存在，但是有一段CpG二核苷酸位点相对集中的区域，并且可以在这个相对集中的区域设计甲基化与非甲基化引物，观察FABP4基因启动子甲基化程度的改变。见图2。

2.3 FABP4基因启动子转录起始位点的预测

用生物信息学方法进行分析比对FABP4基因启动子2 000 bp序列，发现在位于转录起始的-67碱基位置和转录起始的-1548碱基位置含有CAAT盒，而位于转录起始的-808碱基位置含有TATA盒。见图3。

2.4 FABP4基因启动子区不同截取片段PCR产物

通过普通PCR扩增得到与预测截取片段大小相等且规整单一的PCR产物。其中，-2000/-1501片段组、-500/-1片段组、-1000/-1片段组、-2000/-1片段组长度分别为500、500、1 000和2 000 bp。见图4。

2.5 FABP4基因启动子不同截取片段pGL3载体双酶切结果

将构建好的FABP4基因启动子不同截取片段pGL3载体经Hind和Xhol双酶切后用电泳法分离，均被切出大小约4 000 bp的大片段条带和与之相对应的与PCR产物相大小一致的小片段条带。其中，-2000/-1501片段组、-500/-1片段组、-1000/-1片段组、-2000/-1片段组长度分别为500、500、1 000和2 000 bp。大片段的条带与pGl3空载体Hind、Xhol双酶切后的产物大小一致。见图5。

图2 FABP4基因启动子区CpG位点分析

图3 FABP4基因启动子区转录起始位点预测

图4 各FABP4基因启动子片段扩增

图5 各FABP4基因启动子片段酶切鉴定

2.6 FABP4基因启动子不同截取片段的荧光素酶活性

以HEK-293A细胞为工具细胞，分别转入不同长度的FABP4启动子截取片段，检测相应片段的萤光素酶活性，-2000/-1501片段组、-2000/-1片段组、-1000/-1片段组、-500/-1片段组细胞中相对荧光素酶活性分别为（0.2103±0.02741）、（0.3203±0.02978）、（0.1542±0.05314）和（0.2595±0.02686），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=16.900，P=0.000），提示不同长度FABP4启动子截取片段可能具有不同的启动活性。进一步两两比较经SNK–q检验，-500/-1片段组、-2000/-1片段组、-2000/-1501片段组启动活性高于pGL3对照组（P=0.002、0.001和0.011），其中-2000/-1片段组转录活性最强。见图6。

图6 各FABP4基因启动子片段荧光素酶活性检测

2.7 Hcy和5-氮杂胞苷对FABP4基因启动子的作用

将FABP4基因核心启动子-2000/-1片段转染巨噬细胞，并用不同浓度Hcy和5-氮杂胞苷（5-azacytidine, AZC） 干 预 后，0、50、100、200和500μmol/L Hcy组，以及100μmol/L Hcy＋AZC组细胞中相对荧光素酶活性分别为（1.260±0.5585）、（1.430±0.1383）、（4.386±0.1711）、（4.029±0.1673）、（1.582±0.1952）和（5.265±0.3834），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=98.000，P=0.000）。进一步两两比较经SNK–q检验，50和500μmol/L Hcy组与0μmol/L Hcy组比较，差异无统计学意义（P=0.636和 0.400）；100和 200μmol/L Hcy组高于0μmol/L Hcy组（均P=0.001）；100μmol/L Hcy组用DNA甲基转移酶抑制剂AZC作用后，FABP4基因启动活性升高（P=0.002），提示Hcy可以增加巨噬细胞内FABP4核心启动子片段的活性，而DNA甲基转移酶抑制剂AZC可以进一步促进Hcy对FABP4启动子活性的影响。见图7。

图7 不同浓度Hcy对FABP4基因核心启动子活性的影响

3 讨论

本研究发现人FABP4基因2 000 bp长度的启动子区含有3个转录起始结合位点，即由2个启动子区负责转录调控，分别位于-2000/-1051、-500/-1和-1000/-500区域，分别为-2000/-1051区域CAAT盒（序列为CCAAT）、位于-500/-1区域CAAT盒（序列为CCAAT）和-1000/-500区域的TATA盒（序列为TATAAAA）。一般真核生物中蛋白质编码基因的核心启动子元件分4类：①传统的TATA盒；②上游核心启动子元件；③下游启动子元件；④起始子。起始子只起转录起始并无转录调节作用，而上游启动子元件包括CAAT盒和GC盒等，能通过TFⅡ-D复合物的识别和结合来调节转录起始的频率，从而提高转录效率，但并不是所有启动子都含有这些转录基本元件[5]。

CAAT盒是转录因子CBF在DNA序列上的识别结合位点，其序列格式为CCAAT。CAAT盒位于所转录的真核生物基因的近端启动子，与其他启动子元件相互调节而发挥作用，通过控制转录起始的频率从而控制启动子的转录活性，是真核生物基因常有的基本转录区[6]。而TATA盒是另一个重要基础元件，是转录因子TBP识别的DNA序列，其序列格式通常为TATAWAW（W代表A或T）。通常认为，含有TATA盒的启动子可能参与组织特异性基因的转录调控，而TATA盒本身并无转录活性，如果表现出转录活性需要其他结构基因共同调控[7]。在FABP基因2 000 bp启动子区内，CAAT盒位于转录起始的-67碱基位置和转录起始的-1548碱基位置，对应存在的片段为-500/-1片段和-1501/-2000即表现出来转录活性，可以推测FABP4基因是由CAAT盒组成的核心启动子。而TATA盒则位于转录起始的-808碱基位置，存在于-1000/-1片段内而无转录活性，则TATA盒在FABP4转录中可能未起到转录活性作用。

基因启动子和丰富的CpG序列（GC位点通常未甲基化）中的甲基化修饰被认为与基因表达调控高度相关，是体内重要的转录调控方式[8]。一般来说，CpG岛通常是基因中GC含量为60%、CpG出现率达到0.65、长度为500 bp的序列，就算这些区域没有CpG岛也有丰富的CpG位点，可被甲基化修饰调控[9]。在FABP4基因启动子区里，GC含量相对较少，约为38%，在-2000/-1501片段中GC相对集中，含量也仅有47%，因此，FABP4基因启动子不含CpG岛，其调控可能受到散在分布的GC灵活调控。FABP4基因启动子可能是组织特异性表达的基因启动子，CpG位点参与基因表达调控的因素之一。-2000/-1501片段的转录活性高于对照组。由此证明，FABP4基因本身CpG位点相对集中区域也具有启动基因表达的能力。-2000/-1片段转录活性高于-500/-1片段，可以推测CpG对FABP4基因启动子转录调控起一定促进作用，参与FABP4基因表达调控。本研究还发现，FABP4基因启动子-1000/-500片段含有2个AML-1a结合区域（序列分别ACACAC和ACATAA）。AML-1a是一种具有与DNA结合的空间结构域，其缺乏相应转录激活结构域的转录调节蛋白，导致靶基因不能正常转录的机制可能是：一方面，AML-1a与DNA结合的结构域能够和AMLlb/lc竞争结合靶基因DNA结合位点，从而抑制转录；另一方面，AML-1a通过改变基因CpG位点中胞嘧啶（C）甲基化修饰生成5-甲基胞嘧啶（5mC）调控基因转录，该过程在转录调控中最早发生，随后通过激活或抑制转录因子与DNA结合而调节基因转录，这一调控主要集中在GC位点密集区[10]。实验中FABP4基因启动子-1000/-1片段的转录活性低于-500/-1片段，但荧光素酶活性与对照组比较无变化。由此推测FABP4基因-1000/-1片段启动转录过程中可能有负相关调节转录因子参与，或者有相关沉默子起关键作用。AML-1a是否是负责FABP4基因负调控主要的因子及相关转录沉默子的有待进一步研究。同时，包含丰富CpG-2000/-1501片段的-2000/-1片段活性与-1000/-1片段相比又进一步增强，推测-2000/-1501片段对FABP4基因启动子转录活性有非常重要的作用。此外，对照载体pRL-TK所携带的启动子是HSV1-tk基因自身启动子，属中等强度启动子[11]。实验中笔者发现FABP4基因启动子的启动活性均＜40%TK启动活性，由此推测FABP4基因启动子启动基因表达能力较弱。使用不同浓度Hcy干预细胞后，100μmol/L Hcy组启动活性最强。Hcy在体内主要通过2种方式进行代谢：当蛋氨酸过量时，同型半胱氨酸通过转硫化通路代谢，生成胱硫醚（维生素B6为辅助因子），继而转变为半胱氨酸；当蛋氨酸含量较低时，Hcy主要通过蛋氨酸循环途径进行代谢[12]。SAM协助调解的Hcy被再甲基化形成蛋氨酸需要甲基四氢叶酸和维生素B12作为辅助因子，而自然界真核细胞内甲基化修饰反应唯一甲基来源只有SAM[13]。由此推断，当Hcy浓度过高时，迅速消耗培养基中的叶酸和维生素B12，SAM产生减少，FABP4启动子CpG转甲基减少，DNA发生去甲基化，使转录增强。给予叶酸和维生素B12干预后，启动子活性约降低10%，说明补充一定量的叶酸和维生素B12后，SAM产生进一步增多，转甲基能力增强，DNA发生甲基化位点增多，使转录减低。

综上所述，本实验证实FABP4基因启动子属于弱启动子，FABP4基因核心启动子由CAAT盒组成，部分CpG位点参与FABP4基因转录调控，AML-1a可能是调控FABP4基因转录的负性转录因子，而CpG位点与转录因子、沉默子的相互作用有待进一步研究。本研究为进一步研究FABP4基因的功能提供实验基础。