植物多糖通过核因子κB及丝裂原活化蛋白激酶/核因子E2相关因子2信号通路发挥抗氧化作用的机制

王丽雪 解玉怀 杨维仁 杨在宾 张桂国

(山东农业大学动物科技学院，山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，泰安271018)

畜禽生长过程中环境变化、饲粮改变、疾病以及异物代谢等因素均可产生氧化应激,其主要特征表现为体内产生以活性氧(reactive oxygen species，ROS)为主的大量自由基。正常情况下，动物体内存在抗氧化防御系统能够抵御氧化应激的损伤，低强度的氧化应激能激活细胞或机体内的抗氧化防御系统，如提高抗氧化酶的活性或降低氧化酶活性。应激强度持续增强后，细胞或机体内氧化物与抗氧化物的平衡状态被打乱，机体调控抗氧化的能力不足。补充外源性生物活性物质或抗氧化剂增强机体抗氧化能力，是减缓氧化应激的有效途径。生产中通常应用化学合成抗氧化剂，这类抗氧化剂具有高温易变性、致癌及药物残留的缺点。因此，寻求无污染、高效的外源添加的植物源性抗氧化剂成为畜禽生产过程中缓解氧化应激行之有效的方法。

1 植物多糖的特殊结构

植物多糖是植物提取物中的一种重要活性成分，具有多种生物学作用。其生物活性与其特殊的一级结构和高级结构有着密切的关系。

多糖的一级结构是指单糖与糖基的组成、排列顺序、糖苷键类型、糖链长短以及功能性基团。植物多糖由葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖以及木糖等单糖构成，不同于淀粉等常规碳水化合物，植物多糖常以α-1,4-、β-1,3-、β-1,4-和α-1,6-苷键相连。结构单位可以连成直链，也可以形成支链，直链一般以α-1,4-苷键和β-1,4-苷键连成，支链的连接点常是α-1,6-苷键[1]。植物多糖的一级结构复杂，糖基上常连接一些包括磷酸基团、硫酸基团、甲基化基团在内的功能团。植物多糖的高级结构是在一级结构的基础上各侧链通过非共价键相互作用而形成复杂的高级结构。二级结构下，多糖骨架链间以氢键结合成聚合体。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘曲，折叠而形成的空间构象。多糖的四级结构是指多聚链间非共价键结合所形成的聚集体。糖的分子支链分支度与多糖的生物活性密切相关，分支度不同其表现出的生物活性也不同，分支度是植物多糖达到一定生物活性的关键。此外，多糖的分子质量、溶解度、黏度、聚合度、金属离子络合等因素也不同程度影响着植物多糖的生物活性。

2 氧化应激产生的原因及其危害

氧化应激的产生与细胞或机体内氧化物和抗氧化物的失衡有关。畜禽生产过程中冷热环境变化、饲粮改变、饲养管理不完善、疾病等都会引发机体或细胞内自由基的积累，引发氧化应激[2]。细胞或机体本身存在抗氧化防御系统，该防御系统可通过增加抗氧化酶的分泌量或提高酶的活性来清除自由基。当自由基产生的量过多后，内部相应抗氧化系统不足以防御，从而引发了机体或细胞的氧化损伤。通常来讲，氧化损伤主要从DNA、蛋白质、脂肪3个方面表现，包括DNA的修饰、蛋白羰基化水平及脂质氧化变性后丙二醛(MDA)的形成[3-4]。

在不完善的管理条件下，高密度饲养、不良通风、缺乏运动、高能饲粮等因素使得氧化应激在动物养殖中普遍存在，使机体免疫力降低，增加肠炎、肺炎、产后败血症以及乳腺炎等多种畜禽易患疾病的风险[2]。生产中通过添加外源性的抗氧化剂减少饲料中易氧化成分的变质，增强机体抵御氧化应激的能力。这类外源性抗氧化剂主要包括维生素类(维生素C、维生素E等)、微量元素(硒、锌等)，化学合成抗氧化剂[乙氧基喹啉(EMQ)、二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)等]以及植物源性抗氧化剂(原花青素、白藜芦醇等)。由于不能预估畜牧生产过程中发生氧化应激的程度，并且某些外源抗氧化剂相对较高的价格，所添加的外源性的抗氧化剂一般是化学合成抗氧化剂，并且在生产中通常是过量应用的，这就会使抗氧化剂在畜禽体内形成残留，影响产品品质，污染环境。因此，寻求一种价格适宜、绿色无污染的抗氧化剂替代品具有重要意义。

3 植物多糖抗氧化作用的表现

4 植物多糖发挥抗氧化作用的机制及主要信号通路

植物多糖参与调控抗氧化作用的作用机制主要包含以下2个方面：其一，植物多糖能通过调控炎症反应信号(NF-κB)通路调节机体或细胞内相关炎症因子的基因表达情况，缓解氧化应激带来的损伤。其二，植物多糖可以通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/Nrf2信号通路促进细胞对Ⅱ相解毒酶的分泌，促进抗氧化酶的分泌及活性，降低机体或细胞内自由基水平，增强机体或细胞对氧化应激的抗性(图1)。

Polysaccharides:多糖；TLR：Toll样受体Toll like receptor；TIR Domain:Toll/白细胞介素1受体同源结构域 Toll-Interleukin receptor domain；Nrf2：核因子E2相关因子2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2；Keap1：Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1；MAPK：丝裂原激活蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase；JNK：c-Jun氨基末端激酶 c-Jun N terminal kinase；ERK:细胞外信号调节激酶 extracellular signal-regulated kinase；P:磷酸化 phosphorylation；Gene Expression:基因表达；Nucleus：细胞核；NF-κB:核因子κB nuclear factor κB；MyD88：髓样分化蛋白88 myeloid differentiation factor 88；IRAK1：白细胞介素1受体相关激酶1 interleukin 1 receptor associated kinase 1；TRAF6：肿瘤坏死因子受体相关因子6 tumor necrosis factor receptor-associated factor 6；IKKs：核因子κB抑制激酶 inhibitor of nuclear factor κB kinase；IκBα：核因子κB抑制蛋白α inhibitor α of nuclear factor κB；Degraded：降解；MAVs：线粒体抗病毒信号蛋白mitochondria antiviral signaling protein；RIG-1：维甲酸诱导基因1 retinoic acid inducible gene 1；Ub：泛素化 polyubiquitinated。

图1植物多糖发挥抗氧化作用的机理

Fig.1 Mechanisms of resisting oxidative stress by plant polysaccharides[9-11]

4.1 NF-κB信号通路

Toll样受体是先天免疫识别受体家族，能够诱导相关细胞因子的分泌。包括位于细胞内区室(内质网等)的Toll样受体(Toll like receptor，TLR)3、TLR7、TLR8、TLR9，以及位于细胞膜上的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6[12]。当TLR4被激活后招募髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、白细胞介素1受体相关激酶1(IL-1R associated kinase 1，IRAK1)和肿瘤坏死受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)发挥胞内信号的传递[13]。TLR4调控MAPK和NF-κB 2个信号元件，并促使NF-κB转移进入细胞核内，调控下游元件的基因表达[14]。

NF-κB通路是主要的炎性反应信号通路，正常情况下是被IκB所抑制的，但是当机体或细胞处于氧化应激状态下，IκB磷酸化、泛素化后降解，释放NF-κB，使其转移进入细胞核内，调控相关炎症因子的基因表达[15]。植物多糖作用于细胞之后，与细胞膜表面Toll样受体结合并激活相应结合蛋白，调节下游元件的基因表达。炎症反应的加剧可以导致氧自由基在损伤部位的聚积[16]。炎性因子白细胞介素-6(IL-6)和趋化因子IL-8不仅能调节炎症反应，也能开启和维持细胞衰老状态。其基因表达受NF-κB的调控[17]。维甲酸诱导基因(retinoic acid inducible gene 1，RIG-1)与炎症相关，是衰老相关的炎症反应中的重要信号通路，并且一些慢性炎症疾病也证明，发生炎症反应的机体或细胞内RIG-1的蛋白表达上调。IL-6和IL-8基因的表达主要是靠NF-κB和激活蛋白1(AP-1)2个重要元件。在衰老细胞中，RIG-1调控NF-κB信号通路，影响IL-6和IL-8基因的表达[18]。

植物多糖可通过调节炎症反应缓解氧化应激带来的损伤，黄芪多糖显著降低血清中炎症细胞因子水平，表现出抗炎作用，缓解严重烧伤大鼠心肌组织氧化应激所带来的炎症损伤[19]，并且黄芪多糖可通过抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路抑制异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌肥厚症[20]。研究显示，丹参多糖激活NF-κB促使巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞炎性因子的基因表达，提高细胞的免疫性能[21]。蒲公英多糖能抑制NF-κB磷酸化缓解氧化损伤[22]。综合现有研究发现，细胞或机体氧化应激出现后，植物多糖能够通过抑制炎症因子的基因表达缓解氧化损伤。而当细胞或机体处于正常状态时，添加植物多糖后，细胞或机体通过相关炎症信号通路上调炎症因子的基因表达，增强机体免疫性能。

4.2 MAPK/Nrf2信号通路

MAPK包括氧化应激在内的各种刺激进行相应的应答。该通路主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase，JNK)和p38 3条内部信号通路，ERK在细胞内主要与生长激素及因子的基因表达相关，JNK和p38主要是细胞内应答氧化应激相关的重要元件[23]。正常情况下，Nrf2与Keap1在胞浆内耦连并处于相对抑制的状态，当该通路被植物多糖激活之后两者解偶联，Nrf2进入细胞核内，与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)相结合，编码Ⅱ相解毒酶的基因表达，以增加细胞对氧化应激的抗性。植物多糖可以通过MAPK信号通路诱导Nrf2通路，调控Ⅱ相解毒酶的基因表达[24]。

MAPK/Nrf2信号通路是与氧化应激相关的重要信号通路。植物多糖抗氧化作用的研究对该信号通路研究甚广。当细胞或机体处于氧化应激状态下，MAPK/Nrf2信号通路被激活，促进二相解毒酶血红素氧合酶1(HO-1)基因的表达[9]。蒲公英多糖可通过激活MAPK信号通路激活Nrf2诱导HO-1基因的表达[22]。植物多糖激活MAPK/Nrf2信号通路减少细胞内ROS的产生，促进SOD和GPX等抗氧化酶的合成，增强细胞或机体对氧化应激的抗性[25]。植物多糖通过MAPK/Nrf2信号通路维持细胞或机体内氧化系统和抗氧化系统的平衡发挥抗氧化作用。

5 植物多糖抗氧化的应用现状

由于植物多糖抗菌、抗氧化、增强免疫的多种生物学作用，植物多糖对氧化酶的抑制以及对抗氧化酶的激活作用已经成为研究的热点问题之一，与其相关研究也日益增多。但植物多糖的作用机制及应用标准尚未明确，有关机制的研究仍处于探索阶段。

TLR4是植物多糖激活的主要细胞膜受体，近来研究总结出植物多糖中具有类似结构的植物多糖(TLR4相关免疫多糖)能够激活细胞膜表面TLR4的合成，激活相关免疫及抗氧化信号通路。这类多糖由半乳糖、鼠李糖、葡萄糖及阿拉伯聚糖等单糖成分组成。红花多糖[26]、苹果多糖[27]、当归多糖[28]、黄芪多糖[10]、枸杞多糖[29]中均被证明能被TLR4识别，增强机体免疫，缓解氧化损伤[30]。

目前研究较多的植物多糖包含黄芪多糖、苜蓿多糖、刺五加多糖以及枸杞多糖等。黄芪是一种补气血的常用中药材，具有提高机体免疫力、抗疲劳的作用。黄芪多糖是黄芪中的主要活性物质之一。现有的研究显示，黄芪多糖可以抑制因自由基及氧化损伤造成的对线粒体的危害[31]。苜蓿因草质优良、富含优质蛋白质、适应能力强及高产量等特点被称为“牧草之王”。苜蓿多糖是苜蓿草中所提取的重要活性物质之一。研究表明，苜蓿多糖具有清除体内DPPH·的作用，并且可以提高热应激状态下家兔的生产性能及抗氧化能力[32]。而且苜蓿多糖也被证明能能够减少氧化应激对肉鸡肝脏细胞的损伤[33]。刺五加是记录在《本草纲目》中的典型中草药，具有治疗风湿病、高血压等的作用。研究显示，刺五加多糖能够清除DPPH·，提高机体抗氧化能力[34]。枸杞多糖是具有抗衰老作用，能够促进Nrf2核转移，上调HO-1基因的表达，增强机体对氧化应激的抗性[35]。

6 小结与展望

植物多糖是植物提取物中主要活性成分之一，植物多糖对现行所要求的畜禽无抗养殖具有重要实践意义。我国中草药的应用已有悠久历史，而且包括中草药在内的植物资源丰富，研究较多的黄芪多糖、枸杞多糖等均是由中草药中发现应用的，特别是在粮改饲的大趋势下，植物多糖应用于畜禽生产中的研究具有广阔前景。

但是，植物多糖的研究处于初步阶段，其相关应用仍存在很多问题。首先，植物多糖的提取工艺尚未成熟，尚未形成一套完整严格的体系。其次，植物多糖的提取工艺中使用较多有机试剂，对提取后多糖饲用的适口性有较大影响，这是否会影响畜禽的采食量还应进一步探索。第三，提取后的植物多糖浓度不均衡，在畜牧生产中使用的量仍需进一步确定。最后，植物多糖中有机试剂对畜禽机体是否存在致癌的危害尚不明确，去除有机试剂是推广植物多糖目前亟待解决的问题。