重庆某猪场大肠杆菌血清型鉴定及耐药性监测

徐小明 ，钟航 ，葛良鹏 ，孙静 *

（1.重庆市畜牧科学院，农业部养猪科学重点实验室，重庆市养猪科学重点实验室，重庆 荣昌402460；2.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005）

根据发病机制和毒力因子差异，大肠杆菌可大体分为 ETEC、EIEC、UPEC、EPEC、EHEC 5 种血清型[1]。血清型还可以根据不同表面特异性抗原进行分型，优势大肠杆菌抗原种类主要有鞭毛（H）、菌体（O）、表面L型（K）三种抗原[2]。抗原排列不同，大肠杆菌血清型亦复杂多变，可以多达几千种，但致病性大肠杆菌血清型仍分布在有限范围内。本试验从猪只粪便中分离大肠杆菌，进行血清型鉴定、耐药性监测，并建立耐药谱，以期降低该病的发病率，提高治愈率。

1 材料和方法

1.1 样品采集 于重庆某规模化猪场（共12栋猪舍）采集不同年龄段不同猪只的粪便样品49个，并依次编号。其中，哺乳期仔猪1～4号为雄性，5～7号为雌性；保育期小猪8～10号为雄性，11～14号为雌性；生长育肥期中猪15～19号为雄性，20～21号为雌性；妊娠期母猪编号22～28号；哺乳期母猪编号29～35号；空怀期母猪编号36～42号；成熟公猪编号43～49号。采集范围覆盖所有猪舍。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 用无菌拭子伸入猪只肛门内采集粪便[3]，冰盒运输，于-20℃保存。随机抽取不同日龄段的粪便样品各三个，抽样结果：哺乳期仔猪2、3、6号，保育期小猪 8、13、14 号，生长育肥期中猪 15、17、18 号，妊娠期母猪 22、26、27 号，哺乳期母猪 29、31、34 号，空怀期母猪 36、40、41 号，成熟公猪 43、45、48号，共计21个样品。

1.2.2 细菌分离培养 在无菌操作台将粪便样品涂抹于麦康凯培养基，37℃培养18～24h，选取单个可疑菌落交替接种于营养琼脂和麦康凯培养基[4]，重复培养至无其他形态的菌落出现。挑取单个典型菌落进行革兰氏染色、镜检，用营养肉汤培养纯化菌株，与甘油1∶1混合后-20℃保存备用。

1.2.3 生化鉴定 将纯培养物接种于营养琼脂培养基，37℃培养18h后挑取单个菌落接种于硫化氢、甘露醇、尿素、山梨醇、葡萄糖、乳糖生化管，37℃培养24h，观察并记录结果，参考第八版伯杰氏细菌手册进行比对。

1.2.4 耐药性监测 采用药敏纸片法监测21株菌对13种抗生素的敏感程度。方法：吸取200μL菌液均匀涂抹于营养琼脂表面，待菌液完全吸收后，贴上药敏纸片，纸片之间的间隔不少于2.5 cm（避免抑菌圈重叠），37℃培养24h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径（测3组数据取平均值）[5]。敏感程度判断标准：无抑菌圈为耐药；抑菌圈直径＜10mm为低度敏感；10mm＜抑菌圈直径＜15mm为中度敏感；抑菌圈直径＞15mm为敏感。

1.2.5 血清型鉴定 采用玻片凝集试验鉴定21株菌是否是致病性血清型。用专用滴管在洁净的玻片上滴1～2滴血清，取被检菌少许与血清混匀，轻轻摇动玻片，1min内肉眼判断是否凝集，且以生理盐水为对照。结果呈阳性时再与该多价血清对应的单价血清做凝集试验，确定血清型。

1.2.6 DNA提取、16S rRNA区PCR扩增 菌株DNA提取参照酶消化法[6]，具体步骤参照DNA提取试剂盒说明书，提取3、17、34、40号的菌株 DNA（本试验采用抗原分型法对分离的21株菌进行血清型分型，选其中4个样品以确定该猪场大肠杆菌的同源性）。引物采用 16S rRNA通用引物，上游引物：5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,，下游引物：5,-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3,[7]，产物长度约 1500bp。PCR 反应体系：1 μL DNA 模板，2.5 μL 上游引物（10mM），2.5μL下游引物（10mM），5μL dNTP，5μL 10×Buffer，1μL rTaq，33μL ddH2O。PCR 反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性 45s，56℃退火 30s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并寄送苏州金唯智生物科技有限公司进行双向测序。最后，利用 Blast软件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将测序所得的序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对，分析其同源性[8]。

2 结果

2.1 培养、分离、镜检结果 所选21个样品的猪源大肠杆菌分离率为100%。培养基培养结果显示：在营养琼脂培养基上形成圆形、中等大小、四周整齐、光滑湿润、半透明的菌落；在麦康凯培养基上形成圆形隆起、中等大小、四周整齐、桃红色且中间颜色较深、光滑湿润的菌落。镜检观察到两端钝圆，大多数成对存在、少数分散的短杆状红色细菌。

2.2 生化鉴定结果 21株菌的生化特性表现为：甘露醇、乳糖、葡萄糖试验均呈阳性，尿素试验均呈阴性，山梨醇试验大多数呈阴性、少数呈阳性，硫化氢试验多数呈阴性、少数呈阳性。

2.3 耐药性监测 用药敏纸片法监测耐药性，培养出的抑菌圈形状规则、界限明显。分离的21株菌对13种抗生素的敏感程度详见表1。分析可知，该猪场大肠杆菌耐药率分别为：头孢曲松、头孢哌酮、恩诺沙星、环丙沙星0%，新霉素4.76%，诺氟沙星、头孢噻肟9.52%，头孢唑林、阿奇霉素19.05%，四环素71.43%，复方新诺明76.19%，阿莫西林、青霉素100%。

表1 21株细菌对抗生素的敏感程度

图1 21株被检菌的耐药图谱

分离菌株的多重耐药性如图1所示。可见被检菌株均表现出多重耐药性，最少为3耐、最多为6耐，其中4耐最为严重。多重耐药性具体比例为：3耐占 19.05%，4耐占 57.14%，5耐占 9.2%，6耐占14.29%。

2.4 血清型鉴定 血清玻片凝集试验显示：左侧生理盐水无凝集现象，右侧发生凝集，表明该株菌携带致病性血清。所测21个样品中，致病性血清型表现为：3 号哺乳仔猪为肠道致病性 O126∶K71（B16）型血清，48号妊娠母猪为肠道侵袭性O112∶K66型血清，其余均为非致病性血清型。

2.5 电泳成像及Blast比对结果 对16S rRNA通用引物的扩增产物进行电泳检测，结果如图2所示。M为DL2000，可在约1500bp处观察到明显的清晰、无尾条带。

4株菌PCR产物的碱基序列相似度达99%。同源性比对结果表明，所检测序列与Swine fecal bacterium RF1A-Cel5 16s ribosomal RNA partial sequence（FJ753832.1）的大肠杆菌序列相似度达99%，进一步证明所分离菌株为大肠杆菌。

图2 DNA电泳结果

3 讨论

3.1 培养形态和镜检特征 本试验所分离的21株菌均能在麦康凯和营养琼脂培养基上形成单个菌落，形态与林振华等[9]报道的一致。革兰氏染色镜检结果与郭剑英等[10]报道的一致，符合大肠杆菌特性。

3.2 生化特性分析 所分离的21株菌的生化鉴定结果符合大肠杆菌特性。但样品中有少量菌株的硫化氢检测呈阳性，这似乎与其生化特性不符，根据之前也有大肠杆菌硫化氢试验呈阳性反应的报道[11]，并结合镜检结果、DNA序列同源性比对等分析，仍可确认为大肠杆菌。

3.3 耐药性分析 该猪场被检21株菌均表现为多重耐药，以4耐（占57.14%）最为严重。其中对头孢曲松、头孢哌酮、恩诺沙星、环丙沙星无耐药性，建议临床治疗大肠杆菌病使用这些药物；对阿莫西林、青霉素表现为完全耐药，该猪场可以弃用；其余7种药物虽然能在一定程度上治疗大肠杆菌病，但某些菌株已产生耐药性，建议不再使用。在使用药物治疗该病时，建议交叉用药，切记避免持续使用同种药物，以免产生耐药性[12]。

不同地区的大肠杆菌耐药性存在一定的差异，且比较后发现各个地区的大肠杆菌对药物的耐药性都较为严重，因此不同猪场都应常年监测大肠杆菌耐药性，以便及时有效地控制和治疗该疾病。

3.4 血清型鉴定 所测的21个样品中，3号、48号猪只携带致病性血清，已将猪只无害化处理以免扩散。但需要强调的是，大肠杆菌为条件性致病菌，正常菌株在一定条件下也可衍变为致病性菌株。因此，日常养殖中一定要加强饲养管理，采取定期消毒、接种疫苗等方式预防和减少大肠杆菌病的发生和蔓延，确保猪场收益。

4 结论

本试验所分离菌株均为大肠杆菌，且多重耐药性明显，建议使用头孢曲松、头孢哌酮、恩诺沙星、环丙沙星治疗，用药过程中还应避免长时间使用同种药物。其中有两头猪携带大肠杆菌致病性血清，已进行无害化处理。