渥堆条件对黑毛茶主要功效成分的影响

秦俊哲，杨 苗，夏 飞，汪梦雯，曾 桥

(陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021)

0 引言

茯茶因其独特的发花工艺而成为黑茶中一个最具特色的产品，具有消食化积[1]，减肥[2,3]，降血脂[4,5]等功效.茯茶的加工过程是以三、四级黑毛茶为原料，经过切割、筛分、拼配、匀堆、汽蒸渥堆、发花、干燥等一系列工艺过程制成[6].其中，渥堆是形成茶品质的关键工序，其实质是通过微生物胞外酶主导下的生化动力以及热主导下的物化动力使茶叶内含成分发生一系列复杂化学变化，形成茯茶特有风味的过程[1].渥堆过程有助于降低毛茶的青涩味，促进茶叶中功效成分转化，为后续发花过程中冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)快速、大量生长提供物质基础.

茶多酚、咖啡碱、茶氨酸是茶叶的三大特征成分[7].茶多酚具有增强机体抵抗力、抗肿瘤、抗辐射等诸多功效[8-12].茶多酚含量越低，滋味越醇和[13]，茶多酚氧化生成茶黄素(TFs)[14]，可提升茶汤色泽.咖啡碱是茶汤中的苦味来源，具有提神益思，消除疲劳，解热镇痛，提高记忆力，促进消化，降低胆结石机率等诸多保健功能[15].氨基酸是茯茶香气、滋味物质形成的重要前体[16]，具有抗病毒，改善睡眠，缓解焦虑症，改善女性经前综合症，增强肝脏排毒功能等功效[17,18].可溶性糖是茶汤中的甜味成分[19]，可溶性糖能够遮蔽茶汤的苦涩味，增加茶汤醇厚感.其中单糖和双糖是构成茶叶水溶性糖的主要成分[20]，可为茯茶“发花”过程中关键的冠突散囊菌的繁殖提供碳源.

目前茯茶生产企业众多，大多以小作坊式生产，渥堆工艺多凭经验控制，极易造成茯茶品质不高，产品质量参差不齐等现象.近年来，越来越多的学者开始关注渥堆过程在茯茶品质形成中的影响.渥堆过程中的微生物类群活跃，主要为细菌、黑曲霉及酵母[20]；不同渥堆条件对茯茶品质影响已有相关报道[21]，刘石泉等[22]研究了不同渥堆处理后的茯砖茶成品中各理化指标的变化，但对于渥堆过程中黑毛茶功效成分变化以及功效成分与“发花”之间的关系仍不甚明确.

为进一步阐明渥堆条件对黑毛茶功效成分的影响及功效成分对散茶“发花”的作用.本研究通过正交试验方法，研究渥堆工艺中关键因子，原料毛茶水分含量、渥堆温度、渥堆时间对茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸及可溶性糖含量的影响；分析功效成分与冠突散囊菌生长的相关性，揭示渥堆条件对黑毛茶中主要功效成分含量的影响，为进一步科学有效地改良茯茶加工工艺，推动茯茶产业健康发展奠定理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验原料

黑毛茶原料，市售；茯茶发酵剂[23]，实验室自制.

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、琼脂、氯化钠、浓硫酸、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、茚三酮、磷酸氢二钾、浓盐酸、蒽酮、碱式乙酸铅，以上试剂均为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司试剂公司.

1.1.3 主要仪器

紫外可见分光光度计,SP-756PC，上海光谱仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器,LS-C50L，江阴滨江医疗设备厂；电热鼓风干燥箱,101-2，北京科伟永兴仪器有限公司；霉菌培养箱,MJ-160型，上海跃进医疗器械厂；人工气候箱,LRH-400-GS智能型，广东省医疗器械厂；超净工作台,HS-840，苏净集团安泰公司.

1.2 实验方法

本研究在实验室模拟茯茶生产过程，每组称取400 g原料，共9组处理，每组做两个平行.使用高压灭菌锅在100 ℃条件下汽蒸5 min，之后以无菌水调节原料毛茶水分含量，置于人工气候培养箱中在既定条件下进行渥堆.

1.2.1 主要功效成分检测

茶叶样品的制备参照GB/T 8303-2013.茶多酚总量的测定采用酒石酸亚铁比色法进行[24]；游离氨基酸的测定参照GB/T 8314-2013；咖啡碱的测定参照GB/T 8312-2013；可溶性糖的测定采用蒽酮-硫酸比色法[25].

1.2.2 正交试验设计

通过正交设计助手Ⅱ v3.1设计原料毛茶水分含量、渥堆温度以及渥堆时间的3因素3水平L9(33)正交试验，考查各因素对于渥堆后毛茶中茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸及可溶性糖含量四种主要功效成分的影响.

1.2.3 发花验证实验

对不同处理组进行人工接种散茶发花实验[26].发酵剂接种量为1.0‰[27].置于人工气候培养箱中，在28 ℃发花7 d后，50 ℃下烘干，待测.

1.2.4 冠突散囊菌数量

参照GB 4789.15-2016.

1.2.5 冠突散囊菌数量与茯茶渥堆后主要功效成分的相关性分析

应用SPSS 20.0(SPSS statistics,IBM,USA)进行数据分析，冠突散囊菌数量与主要功效成分的相关性采用Pearson相关性分析进行双侧检验.

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果

原料毛茶水分含量、渥堆温度以及渥堆时间的3因素3水平L9(33)正交表设计如表1所示，同时显示茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸、可溶性糖这四种功效成分的含量及其极差分析.

表1 正交试验设计及主要功效成分的极差分析

2.1.1 渥堆条件对茶多酚的影响

图1 不同因素水平对茶多酚含量的影响

2.1.2 渥堆条件对咖啡碱的影响

图2 不同因素水平对咖啡碱含量的影响

2.1.3 渥堆条件对游离氨基酸的影响

图3 不同因素水平对游离氨基酸含量的影响

2.1.4 渥堆条件对可溶性糖的影响

如表1所示，可溶性糖含量受原料毛茶水分含量、渥堆温度以及渥堆时间的影响的极差为：RA>RC>RB，即各因素对可溶性糖含量的影响程度为：A(毛茶水分含量)>C(渥堆时间)>B(渥堆温度).当水分含量从25%提高至35%时，可溶性糖含量剧烈上升，约上升18.1%.

图4 不同因素水平对可溶性糖含量的影响

2.2 “发花”实验

渥堆是茯茶“发花”前的关键工序，渥堆过程中毛茶原料中大分子物质在水热、微生物胞外酶作用下转化为较小分子的物质，可为茯茶“发花”过程中关键的冠突散囊菌的快速生长提供营养物质，为进一步探究渥堆对茯茶品质的影响，对不同条件渥堆后的茯茶原料进行人工接种“发花”.

表2是“发花”后的成品中冠突散囊菌的数量.分析冠突散囊菌的数量与四种功效成分的相关性，结果如表3所示，可溶性糖含量与冠突散囊菌数量显著相关(p<0.05)，其相关系数为0.674.其余三组功效成分均未表现出与冠突散囊菌数量的显著相关性.

表2 不同处理组的冠突散囊菌数量

表3 冠突散囊菌数量与四种功效成分的相关性

*表示在0.05水平(双侧)上显著相关

2.3 讨论与分析

在黑毛茶渥堆过程中，茶叶中大分子物质在微生物胞外酶主导下的生化动力以及热主导下的物化动力作用下，转化为分子量较小的物质，对于形成茯茶独特风味[28]以及为茯茶“发花”过程中关键菌株冠突散囊菌的大量生长提供物质基础.

茶多酚类的转化途径主要有两种：一是酶促氧化，二是自动氧化和水解[29].渥堆过程中微生物的酶促作用促使多酚类分解，茶多酚含量在渥堆过程中呈下降趋势，并与后续的发酵程度呈现负相关[21,30].本研究中，渥堆温度为45 ℃时，渥堆后茶多酚含量较其他温度处理组高.渥堆过程中的主要微生物为细菌，黑曲霉及酵母[20]，极可能是较高的温度抑制了微生物的生长，降低了微生物对毛茶原料中茶多酚的转化作用.而当温度为55 ℃时，茶多酚的自动氧化程度加剧，成为茶多酚含量变化的主要因素，因而55 ℃条件下渥堆后的茶原料中茶多酚含量明显降低.

由于咖啡碱的环状化学结构比较稳定，不易被分解[31]，因此，渥堆温度、渥堆时间对于咖啡碱含量影响较小.但咖啡碱含量随着茶叶原料中水分含量提高而增加，极有可能是由于在较高水分含量下，原料毛茶中本身存在的黑曲霉生长占据优势.研究表明，咖啡碱与霉菌生长有着密切关系[32]，有研究证实，在渥堆过程中微生物产生了一些咖啡碱[33].

在茯茶渥堆过程中，微生物利用茶叶中的氨基酸进行生长，可造成渥堆后氨基酸总量的减少，而茶叶原料中的蛋白质又可降解为氨基酸，因此氨基酸的降解和生成达到动态平衡[34].在水分含量35%时，酵母、霉菌活性较强，分泌较多蛋白酶[35]，进而加速茯茶原料中蛋白质分解的速率.当水分含量逐渐升高时，在湿热及微生物作用下，氨基酸可能发生脱氨、脱羧反应.另一方面汽蒸、渥堆都处于高温、高湿的条件下，会产生亚硝酸盐，亚硝酸可与氨基酸作用生成相应的羟基酸[36]，造成氨基酸含量减少.

茯茶原料渥堆过程中，可溶性糖含量增加可能是由于霉菌等微生物产生的纤维素酶及果胶酶分解纤维素和果胶，产生小分子的可溶性糖[35].在温度达到55 ℃，原料水分含量为45%的高温或高湿条件下，还原糖极易与氨基酸缩合产生希夫碱(Schiff Base)[37]，从而导致可溶性糖含量下降.本研究中，在水分含量由25%上升至35%时，可溶性糖含量剧烈上升，极可能是较高水分条件下，黑曲霉大量生长，分泌出较多纤维素酶，分解纤维素产生糖类物质.可溶性糖含量与茯茶“发花”之后冠突散囊菌数量呈现显著正相关(r=0.674，p<0.05)，即冠突散囊菌丰富度随着茯茶原料渥堆后可溶性糖含量的增加而增加.茯茶“发花”程度是茯茶品质的关键指标[38]，为保证更好的“发花”效果，控制好渥堆条件，促进茶叶中纤维素、果胶等大分子物质转化成可供冠突散囊菌利用的小分子物质，对于提高茯茶品质具有重要的意义.

3 结论

渥堆过程中毛茶水分含量对茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸、可溶性糖四种功效成分含量影响最大.随着毛茶水分含量增加，茶多酚含量下降，咖啡碱含量上升.茶多酚、游离氨基酸含量随渥堆时间的延长而下降，而可溶性糖含量先降低后增加.渥堆温度的升高会提高游离氨基酸含量.相关性分析表明，可溶性糖含量与冠突散囊菌数量呈显著正相关，极可能对后续发花工艺产生影响.因此，以黑毛茶中可溶性糖含量为控制渥堆条件可作为促进茯茶“发花”的有效方式之一.