小胶质细胞老化导致多巴胺能神经元炎性介质释放的研究

曹丹 任艳 罗晓光 魏玲

随着人口老龄化趋势到来, 帕金森氏病(PD)这一中老年常见的神经系统变性病越受到研究者重视, 其发病率随年龄增长而显著增加, 85岁以上的老人接近50%有轻度PD样症状。其发病机制可能与年龄老化、环境因素、氧化应激、线粒体功能障碍、胶质细胞增生和炎症反应等有关, 但线粒体功能障碍早已成为早期病理现象受到研究者们的关注。迄今为止有关PD的治疗均为对症治疗, 无法进行根本有效的病因治疗。因此, 寻找一种能减少多巴胺(DA)能神经元丢失及阻断或延缓病程发展的治疗方法是目前亟待解决的难题。

1 材料与方法

1.1 材料 MI为原代大鼠的神经MI(购于PriCells生物医药科技有限公司)。

1.2 MI培养 MI取对数生长期细胞用于实验, 以终浓度100 ng/ml PMA刺激MI 72 h后为共育时所需老化MI。

1.3 PC12传代培养 复苏后的PC12细胞并传代培养(购于中国科学院细胞研究所), 取对数生长期细胞用于实验。以低剂量250 nM鱼藤酮刺激PC12细胞8 h后, 收集损伤PC12细胞于24孔板上。

1.4 实验分组 将刺激后的MI及转移筛网移入有受损的PC12细胞的培养板内建立两种细胞的共育系统, 实验分为3组：A组(空白对照组)： PC12细胞, 未给予任何处理药物；B组：PC12与老化MI共育；C组：鱼藤酮损伤PC12与老化MI共育。共育24 h结束后移走转移筛板及其上面的细胞,对收集PC12细胞进行膜电位及ROS检测。

1.5 MI老化相关β-半乳糖苷酶(β-gal)染色 每孔加入300 μl β-gal染色固定液, 室温固定 15 min；PBS洗涤3次；每孔加入300 μl染色工作液(试剂盒购于上海碧云天)；37℃无CO2温箱孵育过夜；普通光学显微镜下观察。

1.6 PC12细胞线粒体膜电位检查 采用JC-1标记法(试剂盒购于碧云天, 上海), 加入500 μl JC-1染色工作液, 37℃细胞培养箱中孵育20 min, 吸除上清, 用JC-1染色缓冲液洗涤2次, 加入400 μl细胞培养, 流式细胞仪检测分析。

1.7 PC12细胞内ROS水平检测 细胞收集后悬浮于稀释好的2', 7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)(10 μmol/L)中,37℃细胞培养箱内孵育20 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触, 无血清细胞培养液洗涤3次, 流式细胞仪检测。

1.8 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 多组资料用One-Way ANOVA方法进行比较。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 老化MI形态鉴定 β-gal是一种鉴别细胞衰老的生物学标志。细胞内产生的蓝色沉淀物即表明细胞进入衰老状态。实验结果显示, PMA刺激MI蓝染阳性细胞数明显增加。

2.2 老化MI及鱼藤酮干预对PC12细胞线粒体膜电位的影响 线粒体膜电位是细胞损伤极为敏感的指标之一, 膜电位的下降可以反映细胞凋亡早期的变化。本研究通过流式细胞仪检测PC12细胞线粒体膜电位, 用FL1/FL2评价线粒体损伤情况, 比值越高损伤越严重。实验结果显示, C组FL1/FL2最高, B组、C组FL1/FL2均高于A组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。说明C组细胞线粒体膜电位最低, B组、C组细胞线粒体膜电位均低于A组。

表1 三组FL1/FL2比较( ±s, n=3)

表1 三组FL1/FL2比较( ±s, n=3)

注：与A组比较, aP＜0.05

组别 FL1/FL2 A组 1.03±0.16 B组 1.40±0.10a C组 1.57±0.14a

2.3 老化MI及鱼藤酮干预对PC12细胞ROS水平的影响 本研究通过流式细胞仪检测细胞内二氯二氢荧光素(DCF)荧光强度, 用平均荧光强度值评价细胞内ROS水平。实验结果显示, C组细胞DCF荧光强度最高, B组、C组与A组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。说明C组细胞ROS水平最高, B组、C组细胞ROS水平高于A组。

表2 三组DCF荧光强度比较(±s, n=3)

表2 三组DCF荧光强度比较(±s, n=3)

注：与A组比较, aP＜0.05

组别 DCF荧光强度A组 171.07±17.26 B组 846.97±25.08a C组 982.72±25.1a

3 讨论

MI的激活和炎症反应在PD 神经变性病中的作用越来越受到学者的重视［1］。大量病理学证据均支持MI过度活化是黑质区DA神经元损伤的重要原因, 推测老化MI可分泌各种炎性介质, 持续对周围微环境施加影响。当脑内老化MI大量存在时, 微环境发生改变, 遭遇病理刺激后发生过度炎症反应, 引发氧化应激产物的大量释放, 促进了DA神经元的死亡。研究发现, 线粒体损伤及功能改变在细胞凋亡过程中起到重要作用, 线粒体功能下降包括膜电位减低, 氧化磷酸化-电子传递偶联异常等, 最终导致神经细胞凋亡［2］。调控细胞凋亡的一些因子, 如细胞色素C(Cyt-C)、Bcl-2家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶前体等都定位于线粒体内, 从而破坏线粒体膜的通透性和完整性。

鱼藤酮是一种特异性线粒体复杂体Ⅰ抑制剂［3］。通过抑制线粒体复合体Ⅰ, 促进ROS的形成, 产生氧化应激导致线粒体功能障碍, 从而导致DA神经元的死亡。本实验中老化MI同损伤的神经细胞进行共育, 实验结果发现, 老化MI显著减低了正常PC12和受损PC12的线粒体膜电位并且提高了ROS分泌水平。提示在本实验环境下, 老化MI不利于损伤神经细胞的恢复, 具有神经毒性作用。

近年来, 越来越多研究证实自由基在PD发生发展中起着重要的作用。当线粒体呼吸链受到抑制, 线粒体膜通透性转换可诱导ROS生成。当防御机制受到攻击时, 大量氧自由基积聚造成对膜不饱和脂肪酸的攻击, 引发脂质过氧化作用,使以丙二醛为主的脂质过氧化产物增多, 进一步引起细胞代谢和功能障碍, 造成细胞损伤［4］。ROS是鱼藤酮诱导神经细胞死亡的最重要因素之一。鱼藤酮诱导PC12细胞ROS水平的增加, 在老化MI刺激下, ROS生成进一步加重, 从而进一步损害线粒体电子传递。本研究发现, 在老化微环境中鱼藤酮组PC12可显著增加ROS水平。

综上所述, 线粒体损伤与PD的关系非常紧密, 一方面可以为疾病提供早期诊断提供依据, 从亚细胞和分子水平研究其与PD的关系, 另一方面对新药研发的设计都有重要的指导意义。