芦苇-固定化微生物联合修复胶州湾湿地土壤中苯并[a]芘的研究*

金 鑫，田伟君,2**，乔凯丽，龚晓希，赵 婧，刘淑惠

(1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100；2.海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100)

胶州湾湿地是山东半岛面积最大的河口海湾型湿地，湿地总面积约17.76万hm2，具有重要的生态、水文与环境功能[1]。然而，胶州湾周围加速的城市化和工业化使大量污染物进入湿地生态系统，导致其污染不断加剧。因来源丰富、毒性强、难降解，多环芳烃(PAHs)已经成为沿岸湿地中最主要的污染物之一。胶州湾湿地土壤中PAHs(16种被美国环保署列为优先污染物的PAHs)的含量明显高于黄河三角洲土壤中PAHs 含量(27.45～128.97 ng·g-1)[2]，而苯并[a]芘(BaP)含量又是致癌性PAHs中含量最高的一种[3]。

BaP是一种毒性大，具有致癌、致畸、致突变效应[4]的五环PAHs。它是第一种被发现的环境化学致癌物，1997年被美国环境保护署(EPA)列为了优先控制PAHs。作为一种高环PAH，BaP的水溶性低，且由于湿地中降解BaP的微生物活性较低且老化了的BaP的生物有效性也较低，所以BaP在湿地中的自然降解过程十分缓慢[5-6]。本文分别以苯并[a]芘或芘和苯并[a]芘为唯一碳源和能源，用梯度驯化法从胶州湾湿地的石油污染土壤中筛选出2株BaP降解菌，以改性煤渣和聚乙烯醇(PVA)为载体材料将其制成固定化生物煤渣粒，并添加到种植了芦苇的受试土壤中，以达到强化BaP降解的目的。此外，添加生物煤渣粒对土壤中微生物群落多样性的影响也在文中被分析。

1 材料与方法

1.1 BaP降解菌的筛选及鉴定

采集胶州湾湿地受石油污染的土壤，分别以BaP或芘和BaP为唯一碳源和能源，经梯度驯化法从土壤中筛选BaP降解菌。以BaP为唯一碳源时，BaP的浓度梯度为5、25、50、75、100 mg/L；以芘和BaP为唯一碳源时，芘和BaP的浓度梯度各为2.5、12.5、25、37.5、50 mg/L。其中，MSM的组成为：0.5 g (NH4)2SO4; 0.5 g NaNO3; 0.02 g CaCl2; 0.2 g MgSO4·7H2O; 1.0 g KH2PO4; 1.0 g NaH2PO4; 0.005 g FeSO4·7H2O; 1 mL 微量元素混合溶液(35 mg (NH4)6Mo7O24·4H2O; 40 mg MnSO4·H2O; 43 mg ZnSO4·H2O，无菌水定容至1 L)，无菌水定容至1 L，调节pH至7.0。

为了确定筛选出的菌株对BaP的降解能力，在液体体系中进行了菌株对BaP的降解实验。将筛选出的两株菌分别加到Luria-Bertani液体培养基中，并在30 ℃、150 r/min条件下培养至OD600为1.0。准备若干灭菌的三角瓶，向各三角瓶中加入等量的BaP和18 mL无机盐液体培养基，使BaP的初始浓度为40 mg/L。然后将三角瓶分为三组，第一组中加入2 mL以BaP为唯一碳源和能源筛选出的菌液，第二组加入2 mL以芘和BaP为唯一碳源和能源筛选出的菌液，第三组不加菌，而加入2 mL Luria-Bertani液体培养基作为空白对照组。将所有三角瓶置于30 ℃、150 r/min 条件下震荡培养，采用整瓶批次采样[7]的方式每2 d取样，用GC-MS测定各组三角瓶中BaP的剩余浓度。

对菌株JB1和JB2分别进行基于16S rDNA基因的测序分析，将测得的细菌序列通过Blast在GenBank中进行相似性检索。

1.2 BaP降解菌的固定化

首先将菌株JB1、JB2混合置于LB液体培养基中于30 ℃、150 r/min下培养至对数期，之后以改性煤渣和改性PVA为载体材料，通过包埋的方式将JB1 JB2固定化[8]，具体操作如下：首先将100目煤渣置于6 mol/L盐酸中浸泡24 h后，反复冲洗至pH达到6～7，以去除煤渣中存在的对微生物有害的金属如Al、Cr、Cu、As、Hg、Cd、Pb等[9]。将经灭菌的改性煤渣、改性PVA和生长至对数期的BaP降解菌充分混合，三者比例为18∶15∶2(g,mL,mL)，制成直径为6～8 mm的球。制成的固定化微生物小球先于4% CaCl2溶液中浸泡12 h，充分交联，再在无菌水中浸泡3 d，最后在增值培养基中震荡培养3 d，每日续加增殖培养基。

采用李婧[10]的方法测定固定化小球的直径、密度、传质性能、机械性能。参照Chunk和Okabe的方法[11]利用扫描电镜(JSM-840,日本)观察固定化煤渣粒的微观结构及其中包埋的菌的生长情况。分别使用BET仪(ST-08A)和EDS能谱分析仪(FEI Quanta 200FEG)测定载体煤渣的比表面积和主要元素组成。

1.3 芦苇—固定化微生物联合降解BaP

设置4个相同的湿地模拟装置A-D，向各装置中加入等量的污染土壤，并分别对各装置中的土进行如下处理：

Plot A：不做任何处理，作为空白对照组；

Plot B：在距离土壤表层10 cm深处添加300 g生物煤渣粒(包埋菌量为0.6×109～1.2×109cells)；

Plot C：种植4株芦苇；

Plot D：种植4株芦苇并在距离土壤表层10 cm深处添加300 g生物煤渣粒(包埋菌量为0.6×109～1.2×109cells)。

将湿地模拟装置放置在室外自然环境下，并使土壤含水量保持在30%～40%。分别于0、2、4、6、10、14、20、30、42、60 d采集土壤样品，将采集的土壤样品放置在低温避光条件下风干。使用超声萃取法[3]提取土样中的PAHs，并用GC-MS进行定量分析。在第0、2、4、6、10、14、20 d同一时间采集Plot C和Plot D组中芦苇的根系分泌物，样品经0.22 μm滤膜过滤，用离子色谱(ICS-5000)测定其中氨基酸、可溶性糖及低分子量有机酸的含量。

1.4 生物煤渣粒对微生物群落结构的影响

为了判断生物煤渣粒的加入对土壤微生物群落结构的影响，选取模拟实验开始后第0、42、60天从湿地模拟装置D中采集的土壤样品为研究对象，使用Power Soil DNA提取试剂盒提取土壤中微生物的DNA，并进行基于16S rDNA的高通量测序。根据对测序结果的分析，得出土壤中微生物的多样性及群落结构方面的信息。

2 结果与讨论

2.1 BaP降解菌及其性能分析

以BaP或芘和BaP为唯一碳源和能源，经梯度驯化从污染土壤中筛选出了2株BaP降解菌，分别命名为JB1和JB2。对JB1(登录号为KU199711)和JB2(登录号为KU199712)菌株的16S rDNA基因进行测序，将两菌株的基因序列通过NCBI的BLAST程序比对，发现两株菌均与假单胞菌属的多个菌株具有相似性。其中，JB1与Pseudomonasveronii同源性最高，同源率达到97.9%，JB2与Pseudomonasplecoglossicida相似度最高，达到97.0%。JB1、JB2的系统发育树如图1。结合菌株形态及16S rDNA系统发育树位置，确定JB1和JB2为假单胞菌(Pseudomonas)。

为了进一步确定菌株JB1、JB2对BaP的降解能力，在液体体系中分别进行了JB1和JB2对BaP的降解实验，结果在BaP初始浓度为40 mg/L的情况下，经过24 d的降解，JB1、JB2对BaP的降解率分别达到65.2%和61.0%(见图2)。这说明菌株JB1、JB2对BaP具有较强的降解能力。已有的研究也已证实一些假单胞菌属的细菌能够降解包括BaP在内的PAHs[12-15]。

2.2 生物煤渣粒及其理化性质

以改性煤渣和改性PVA为载体，通过包埋的方式将生长至对数期的JB1和JB2混合菌株固定化，得到固定化生物煤渣粒。固定化煤渣粒的直径为6～8 mm，密度为1.5～2 g/cm3。其机械程度高，经48 h的机械震荡(转速为300 r/min)，全部都完好无损，说明固定化煤渣粒能够抵抗外界一定的环境压力[16]。传质性能以公式(1)进行表征，生物煤渣粒吸附了92.8%的亚甲基蓝，表明它的传质性能较好，微生物生长所需的营养物质和排出的代谢废物能够自由进出，不受限制，进而起到高效降解作用。

图1 菌株JB1(a)和JB2(b)基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on bacterial 16S rDNA sequences of the isolate JB1 (a) and JB2 (b)

图2 无机盐培养基中JB1和JB2对BaP的降解曲线Fig.2 Biodegradation curve of benzo[a]pyrene by JB1 and JB2 in MSM

A=(A0-A1)/A0

(1)

用扫描电镜对生物煤渣粒进行观察，结果如图3所示。固定在煤渣内部的菌长约1～2 μm，宽约0.5 μm，其大于煤渣的孔径，故菌能够稳定存在于煤渣球内部，从而避免了外界不利环境条件的影响。同时，煤渣疏松多孔，能有效地与外界进行氧气、营养物质和代谢废物的交换，从而有助于微生物的生长及对污染物的降解，这与煤渣粒传质性能的测试结果相一致。

对载体材料比表面积和元素组成进行分析发现，改性煤渣作为一种载体材料，能为微生物的生长和代谢提供营养，促进微生物对污染物的降解。一方面，载体煤渣的比表面积为26.14 m2/g，而经改性后的煤渣的比表面积增加到了37.74 m2/g，较大的比表面积和较多的孔径有利于煤渣粒吸收营养物质和氧气[17]，并且可以增加生物煤渣粒与污染物质的接触面积，起到加速BaP降解的作用。另一方面，煤渣的主要组成元素为C、O、N、Si、Fe、Ca、Mg、Al、Cr、Cu、As、Hg、Cd、Pb等。其中，Al、Cr、Cu、As、Hg、Cd、Pb等金属元素对微生物和环境是有害的。而煤渣经盐酸改性后，有害金属元素则大幅度去除，C、O成为最主要的元素，分别占55.10%和26.08%，此外还有Si、Fe、N等元素，这些元素可以作为微生物的营养物质，且煤渣上的大量含氧官能团还有利于其与土壤中污染物的结合与反应，进而促进BaP的降解。

图3 包埋菌株JB1和JB2的固定化煤渣粒的扫描电镜图Fig.3 Scanning electron microscopy (SEM) micrographs of srain JB1 and JB2 immobilized in the coal cinder beads

2.3 BaP的生物降解效果分析

经42 d的降解，四个湿地模拟装置中土壤的BaP含量均有不同程度的降解。Plot A-D组土壤中BaP的降解率分别为15.1%、54.6%、28.9%和69.3%。添加生物煤渣粒(Plot B)、种植芦苇(Plot C)、添加煤渣粒并种植芦苇(Plot D)的湿地模拟装置中的土壤中BaP的降解率均高于对照组(Plot A)，且固定化微生物和芦苇共同作用的结果比生物煤渣粒或芦苇单独作用的效果好，这说明两者能在一定程度上对BaP的净化起到协同作用。这种协同作用在Toyama等的研究中也有所体现。Toyama等[18]发现分枝杆菌与芦苇根系分泌物之间的相互作用能够加速芦苇根际沉积物中芘和苯并[a]芘的生物降解。

本文中Plot D装置中BaP降解效果最好的原因如下。一方面，芦苇能够吸收转化一部分PAHs，芦苇根际分泌物能够增强微生物活性[19-22]，微生物对BaP的降解又促使芦苇产生更多的根系分泌物。在整个实验期间，检出的芦苇根系分泌物主要有精氨酸、海藻糖、马来酸、琥珀酸和乙酸，如图4。种植芦苇并添加生物煤渣粒的Plot D中的精氨酸含量整体上低于只种植芦苇(Plot C)中的含量，且随着降解的进行，精氨酸含量不断减少，说明精氨酸可能作为营养物质或苯并[a]芘的共代谢物[23]而被微生物所利用，进而促进BaP的降解。Plot D中海藻糖的含量也低于Plot C，但随着降解的进行，其含量不断增多，说明海藻糖不仅可以作为营养物质促进BaP的降解，还可以作为细胞壁的结构[24]，在植物和微生物生长的刺激下不断分泌。而Plot D中低分子量有机酸(马来酸、琥珀酸、乙酸等)的含量则高于Plot C，说明低分子量有机酸在生物煤渣粒的刺激下得以更多的分泌。有研究表明，低分子量有机酸作为植物根系分泌物的主要组成成分，不仅可以使吸附在土壤有机质上的污染物释放出来[25-29]，还可以影响微生物的表面[30]，加强降解菌与污染物的联系[31]，进而促进其降解。另一方面，生物煤渣粒增加了接种微生物的数量及其稳定性，加快了微生物降解BaP的反应启动速度[32-33]；如前文所述，其载体材料煤渣疏松多孔，比表面积大，富含多种营养元素，能够保证固定化生物煤渣粒和外界高效地进行营养物质、氧气及代谢废物的传输，增加微生物与BaP接触的面积，从而促进BaP的降解。

图4 湿地模拟装置中芦苇和菌株JB1、JB2联合作用对苯并[a]芘的去除曲线Fig.4 Wetland simulator studies on BaP depletion in BaP-contaminated soil by reeds and strains JB1 and JB2 immobilized in cinder beads as a function of time

图5 Plot C和Plot D中根系分泌物的含量变化Fig.5 Root exudates detected in plots experiments and their change in Plot C and Plot D

2.4 固定化生物煤渣粒对土壤微生物群落多样性的影响

选择Plot D组在实验第0、42、60 d的土样为研究对象，编号为S1-S3。提取土样中微生物的DNA，并进行高通量测序分析，根据分析结果计算各土样的Shannon指数，以此分析添加固定化生物煤渣粒对土壤微生物群落多样性的影响。样品S1、S2的Shannon指数分别为9.1、4.9，说明添加固定化微生物后，对土壤中土著微生物产生了较大的影响，使土壤中微生物群落的多样性明显减小，这与类似的研究结果相一致。Huang等[8]采用芦苇—固定化微生物对土壤中芘和茚并(1,2,3-cd)芘进行净化后，土壤中微生物群落的多样性也大幅减少，Shannon指数由实验开始时的9.3减至5.3。本文又分析了实验第60 d的土壤样品S3的Shannon指数，结果表明在BaP的降解结束后，土壤经过一段时间的恢复，其中微生物群落的多样性也有所恢复，Shannon指数又回升至7.2。这说明向土壤中添加固定化生物煤渣粒不会对土壤造成不可逆的负面影响。

在属水平上分析了S1-S3各土壤样品中物种的相对丰度，如图5。未添加固定化微生物的S1土壤样品中，约有90%的数据信息不能在属水平上进行准确分类，大多数的属所占比例不到1%，占比超过1%的属有Pseudomonassp.、Rhodoplanessp.、Kaistobactersp.、CandidatusSolibactersp.、A4和Bacillussp.，分别占1.99%、1.78%、1.75%、1.22%、1.03%和1.00%，各属分布较平均，含量前十中最低的属也占到0.20%。在添加固定化微生物42 d后，土壤的微生物群落结构发生了显著变化，Pseudomonassp.是明显的优势种，占到了20.23%，说明其在BaP的降解中占据绝对优势，能表现出较高的活性[34]。Mycobacteriumsp.和Achromobactersp.也是S2土壤样品中的优势种，它们也是常见的PAHs降解菌[35-37]，会对BaP的降解起到促进作用。在添加固定化微生物60 d后，因为降解已经停止，经过一段时间的恢复，土壤中微生物的多样性得到一定的恢复，尽管Pseudomonassp.仍占据优势，但其占比相对于S2土样已经明显降低，各属微生物的占比也趋向均匀化。高通量测序结果表明，向土壤中添加固定化微生物对BaP降解进行降解时，土壤中主要以降解PAHs的细菌群落为主，降解结束后，土壤中微生物的群落结构则可以缓慢恢复。

图6 属水平上各样品物种相对丰度的变化Fig.6 Composition and relative abundance of bacterial classes in phylum Proteobacteria based 16S rDNA sequences

3 结语

分别以苯并[a]芘、芘和苯并[a]芘为唯一碳源，从胶州湾湿地污染土壤中筛选出了两株BaP高效降解菌，分别命名为JB1和JB2。在BaP初始浓度为40 mg/L的条件下，经过24 d的降解，BaP分别被去除了65.2%和61.0%。菌株JB1和JB2的测序结果表明二者均是假单胞菌(Pseudomonassp.)。以改性煤渣、改性PVA为载体，将JB1和JB2的混合菌株以包埋的方式固定化为生物煤渣粒，该固定化煤渣粒机械强度及传质性能高且疏松多孔，有利于微生物与外界环境进行营养物质、氧气和代谢废物的交换。载体煤渣富含多种元素、比表面积大，可为微生物提供营养物质并增加微生物与BaP的接触面积。湿地模拟实验表明，种植芦苇并投加固定化生物煤渣粒情况下，BaP的去除率高于芦苇或固定化生物煤渣粒单独作用的结果，芦苇和生物煤渣粒可以协同降解BaP。此外，向土壤添加固定化微生物后，随着微生物对BaP的降解，土壤中微生物的多样性明显降低，群落结构趋向于以降解PAHs的细菌为主，如Pseudomonassp.，Mycobacteriumsp.，Achromobactersp.；降解结束18 d后，土壤中微生物的多样性明显提高，群落结构也在一定程度上得到恢复。进而说明用芦苇-生物煤渣粒联合修复湿地的PAHs污染不会对湿地土壤造成不可逆的负面影响。