红花玉兰MwZFP10基因的克隆及功能分析

梁 爽，肖爱华，马 江，陈发菊，桑子阳，马履一*

(1 北京林业大学 林学院 省部共建森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083；2 三峡大学 生物技术研究中心，湖北宜昌 443002；3湖北五峰土家族自治县林业科学研究所，湖北五峰 443413)

C2H2类锌指蛋白是一类调控植物生长发育和响应逆境胁迫等过程的重要转录因子[1]。SUPERMAN类基因是C2H2家族中的一类编码单锌指蛋白的基因，在其N端和C端分别含有一个高度保守的结构域QALGGH和L/IDLELRLG。SUPERMAN类基因广泛参与花器官发育、植株生长、形态建成、激素调控及逆境响应等过程[2-4]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，目前已发现了33个SUPERMAN类基因[5]，其中，SUPERMAN基因是首个克隆的SUPERMAN类基因，具有抑制花器官原基细胞过度分裂的功能,在控制雄蕊和心皮的边界形成中起作用。根据花发育的ABC模型，A功能基因在第一、二轮花器官中表达，B功能基因在第二、三轮花器官中表达，而C功能基因则在第三、四轮表达[6]。SUPERMAN基因通过限制B类花器官特征决定基因(APETALA3和PISTILLATA)在雄蕊中的表达，进而影响雄蕊和雌蕊的分化[7]。在SUPERMAN基因的突变体中，第三轮花器官分生组织细胞过度分裂，从而影响了心皮的发育，最终在心皮位置形成了雄蕊[8-9]。随后又在拟南芥中陆续克隆研究了AtZFP1、RBE、AtZFP10、AtZFP11、KNU和SAZ等基因。AtZFP1基因具有抑制细胞分化的能力，过表达AtZFP1基因使得拟南芥愈伤不能进一步分化再生成小苗[10]。拟南芥的RBE基因在花瓣原基的早期分化中起重要作用，在rbe突变体中，第二轮花器官发育缺陷，出现与萼片融合的现象，表明RBE能够控制第一轮和第二轮花器官边界的形成[11-12]。拟南芥的KNU基因具有抑制细胞增殖，调控雌蕊的形成和发育的功能[13]。在矮牵牛、水稻、杨树、棉花、苹果以及大豆等植物中同样也存在有该类单锌指蛋白[5]。矮牵牛的PhSUP1基因与SUPERMAN相似，可恢复拟南芥的superman突变体表型[14]。大豆的GmZFP1基因在花瓣和雄蕊以及种子发育后期表达升高[15]。陆地棉的GZFP基因在花器官中较其他器官表达增强，并参与植物的抗逆调节[16]。过表达苹果的MdSUP3基因，转基因烟草呈现植株矮化、节间缩短、叶片卷缩和花色加深等表型，部分花器官形态异常[17]。

红花玉兰(Magnoliawufengensis)是2004年在湖北五峰发现的木兰科植物新种，其为落叶高大乔木，花杯型，先叶开放，花色内外全红，花被片倒阔卵形，数目9(～12)瓣[18]。课题组前期先后展开了红花玉兰种质资源、育苗技术、抗逆性研究以及花器官特征决定基因的功能的研究[19-24]。花器官多样性是红花玉兰最具观赏价值的性状，系统地开展红花玉兰花器官发育相关基因的研究，并运用到育种生产实践中，对红花玉兰花型改良与种质创新具有重要的学术意义和应用价值。红花玉兰‘娇红1号’是通过采取红花玉兰接穗嫁接的方式从高海拔地区到低海拔平原地区进行引种繁育，将原生母树优良的观赏性状固定下来培育而获得的新品种。本研究从红花玉兰新品种‘娇红1号’中克隆得到一个SUPERMAN类基因MwZFP10，通过RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法获得了该基因CDS(coding sequence)全长序列，并通过生物信息学分析了MwZFP10的序列结构信息、理化性质，采用半定量和实时荧光定量PCR的方法分析其在红花玉兰花器官各组织的表达模式，并通过转基因功能分析进一步探究了MwZFP10基因在植物花器官发育中的功能。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理方法

2017年3～5月在湖北五峰红花玉兰苗木繁育基地，分别采集红花玉兰‘娇红1号’的花芽、花被片、雄蕊、雌蕊以及叶片和苞片。经液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。采用EASYspin植物总RNA提取试剂盒(艾德莱，北京)提取红花玉兰花芽的总RNA，并使用NanoDrop2000(Thermo Scientific，美国)和1%凝胶电泳检测RNA的质量。采用Reverse Transcription System逆转录系统(Promega，美国)对总RNA逆转录合成第一链cDNA。

1.2 方 法

1.2.1红花玉兰MwZFP10基因的克隆根据红花玉兰转录组测序差异显著表达基因数据库中已获得的MwZFP10基因645 bp片段设计3′-RACE引物3′-RACE-MwZFP10-F1和3′-RACE-MwZFP10-F2(表1)。参照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase试剂盒(TaKaRa，大连)中的RACE克隆方法扩增MwZFP10基因3′-末端未知序列。5′-末端序列和3′-末端序列比对和拼接后，获得MwZFP10基因序列全长。

1.2.2红花玉兰MwZFP10基因序列结构分析以及系统发育分析利用DNAMAN软件对MwZFP10基因cDNA序列进行编码区预测。利用BLAST工具在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行核酸序列的同源性分析。将MwZFP10基因的蛋白序列在NCBI 数据库中执行BlastP搜索(https://blast．ncbi．nlm．nih．gov /Blast．cgi)。选取来源于不同被子植物的12个SUPERMAN同源蛋白，采用MEGA 6.0软件的邻位近邻法(NJ)构建蛋白氨基酸序列的系统发育树。同时，采用BioEdit软件，对MwZFP10蛋白进行结构域分析。

1.2.3红花玉兰MwZFP10生物信息学分析利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)分析MwZFP10蛋白的理化特性和氨基酸组成；利用Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析MwZFP10蛋白疏水性；利用TMpred Server(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析MwZFP10蛋白的跨膜结构域；利用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测MwZFP10蛋白的信号肽区域；利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL工具(http://swissmodel.expasy.org/interactive)分别预测MwZFP10蛋白的二级结构和三级结构；利用WoLF PSORT (https://www.genscript.com/wolf-psort.html) 预测MwZFP10基因的亚细胞定位。利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测MwZFP10蛋白磷酸化位点。

1.2.4红花玉兰MwZFP10基因表达模式分析分别提取红花玉兰‘娇红1号’的花被片、雌蕊、雄蕊、叶片和苞片的总RNA，并分别以2 μg总RNA为模板逆转录合成第一链cDNA。通过半定量RT-PCR方法检测MwZFP10基因在红花玉兰花被片、雌蕊、雄蕊、叶片和苞片中的组织表达特异性；半定量RT-PCRMwZFP10基因的引物为RT-MwZFP10-F和RT-MwZFP10-R，并以红花玉兰Actin基因作为内参，引物为RT-Mwactin-F、RT-Mwactin-R(表1)，所用试剂为2×TaqPCR StarMix(GenStar，北京)。采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析MwZFP10基因在不同部位的相对表达量。实时荧光定量MwZFP10基因的引物为QMwZFP10-F和QMwZFP10-R，并以红花玉兰Actin基因作为内参，引物为QMwactin-F和QMwactin-R(表1)，所用试剂为FastStart Universal SYBR Green Master(Roche，德国)。反应程序为：95 ℃ 5 min预变性后,95 ℃保持30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min, 重复35个循环。实时荧光定量数据分析采用2-ΔΔCt法计算MwZFP10基因各器官的相对表达量。

表1 引物序列

1.2.5基因表达载体的构建及拟南芥转化选择pBI121作为基因表达载体。首先通过PCR扩增在MwZFP10基因编码区的上、下游分别引入BamHI和SacI酶切位点，随后利用限制性内切酶BamHI和SacI(New England Biolabs，美国)对上述MwZFP10基因PCR产物和pBI121植物表达载体分别进行双酶切，并将酶切后的目的基因片段重新连接至pBI121载体的XbaI和SmaI位点之间，构建重组质粒35S∷MwZFP10。MwZFP10基因表达载体构建所用的引物为MwZFP10 BamH I-F和MwZFP10 Sac I-R(表1)。随后通过液氮冻融法将重组质粒35S∷MwZFP10转化GV3101-90农杆菌，并通过农杆菌介导的花序浸染法转化Col-0野生型拟南芥[25]。T1代种子在含有50 μg/mL卡那霉素的MS培养基上筛选2周后，将长势良好、真叶叶片及生长点呈绿色且根部可深入培养基的植株(初步鉴定为阳性转基因苗)移栽到人工光照培养箱中培养(白天22 ℃ 16 h，黑夜20 ℃ 8 h)。培养2周后分别提取初步筛选的阳性转基因苗的DNA，并进行目的基因的PCR检测。阳性转基因植株PCR鉴定的引物为MwZFP10-F和MwZFP10-R(表1)。

2 结果与分析

2.1 红花玉兰MwZFP10基因的克隆与序列分析

利用RACE克隆技术从红花玉兰中获得了SUPERMAN同源基因，命名为MwZFP10，GenBank登录号为MH037314。序列分析结果表明，获得的MwZFP10基因cDNA序列共1 117 bp，包括138 bp的5′-UTR、726 bp的ORF和253 bp的3′-UTR，编码241个氨基酸和1个终止密码子(图1)。

2.2 蛋白序列比对与系统发育分析

蛋白序列比对结果显示(图2)，在MwZFP10蛋白的N末端和C末端分别含有SUPERMAN类蛋白典型的高度保守的结构域：QALGGH和IDLELRLG。在不同来源的SUPERMAN类蛋白之间，除了这2个结构域及其附近的碱基序列高度保守之外，其他序列均呈现高度差异。系统进化分析显示，MwZFP10蛋白与PhSUP1、SlSUP、SUP、AtZFP11、AtZFP10、GZFP、RBE蛋白共聚于一个分支，GmZFP1、AtZFP1和KNU共聚于另一分支(图3)。红花玉兰MwZFP10与拟南芥AtZFP10聚为一类，因此命名该基因为MwZFP10。

2.3 MwZFP10蛋白理化性质分析

ProtParam分析结果显示MwZFP10蛋白的分子式是C1128H1760N322O383S14，蛋白质分子量为26.4 kD，等电点为4.42，富含丝氨酸(Ser)和亮氨酸(Leu)，含量分别为12.4%和9.1%，并包含33个负电荷氨基酸残基和17个正电荷氨基酸残基；疏水性分析显示，酪氨酸(Tyr131)分值最大为2.156，天冬氨酸(Asn216)分值最小为-3.544，疏水性位点和亲水性位点均匀分布，推测该蛋白为亲水性蛋白(图4，A)。TMTHMM分析结果显示MwZFP10蛋白不含有跨膜结构域(图4，B)。SignalP分析结果显示，在MwZFP10蛋白中没有信号肽结构域(图4，C)，推测其不属于分泌蛋白。NetPhos分析结果显示MwZFP10蛋白中共有18个可能的蛋白磷酸化位点，包括14个Ser位点，3个Thr位点和1个Tyr位点(图4，D)。SOPMA分析结果显示α-螺旋(Hh)，延伸链(Ee)和β-转角(Bt)构成了红花玉兰MwZFP10蛋白的基本结构，分别占20.33%、21.99%和7.47% (图5)。SWISS MODEL分析结果显示MwZFP10蛋白呈现典型的锌指空间构型(图6)。亚细胞定位预测结果显示MwZFP10蛋白nucl: 11；cyte: 1；extr:1，细胞核分数明显高于细胞质及其他部位，推测其可能定位在细胞核中。

起始密码子和终止密码子用下划线标记，加粗字母为polyA 尾巴，加粗字体且下划线标记为氨基酸保守序列图1 MwZFP10基因的核酸序列与氨基酸序列Initiation codon(ATG) and termination codon(TAA) are underlined, the bold letters are polyA tail, the amino acid conserved sequence is underlined and boldFig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of MwZFP10

GmZFP1. 大豆(NP_001237732.1)；GZFP. 陆地棉(AAZ79470.2)；KNU. 拟南芥(NP_196905.1)；LIF. 矮牵牛(BAB58897.1)；MwZFP10.红花玉兰(MH037314)；PhSUP1. 矮牵牛(AB117749)；RBE. 拟南芥(OAO94874.1)；SAZ. 拟南芥(NM_117891)；SlSUP. 白麦瓶草(BAH59432.1)；SUP. 拟南芥(AAC49116.1)；框内示意SUPERMAN类蛋白的保守序列。相似性：黑色=100%；粉色≥75%；蓝色≥50%图2 MwZFP10及同源蛋白的多序列比对GmZFP1. Glycine max(NP_001237732.1); GZFP. Gossypium hirsutum(AAZ79470.2); KNU. Arabidopsis thaliana(NP_196905.1); LIF. Petunia hybrida(BAB58897.1); MwZFP10. Magnolia wufengensis(MH037314); PhSUP1. Petunia hybrida(AB117749); RBE. Arabidopsis thaliana(OAO94874.1); SAZ. Arabidopsis thaliana(NM_117891); SlSUP. Silene latifolia(BAH59432.1); SUP. Arabidopsis thaliana(AAC49116.1); The box indicates the conserved sequence of SUPERMAN like zinc finger protein. Conserved percent: Black=100%; Pink≥75%; Blue≥50%Fig.2 Multiple sequence alignment of MwZFP10 and homological proteins

MEGA6.0用于构建系统发育树，计算方法为邻位相连法。每个分支上的数字表示1 000次重复搜索的置信度图3 MwZFP10蛋白与其他植物相关蛋白氨基酸序列的系统进化分析MEGA6.0 is applied to construct the tree by Neighbor-joining method. Numbers on branches indicate bootstrap estimates for 1 000 replicate analysisFig.3 Phylogenetic analysis of MwZFP10 protein with other related proteins in different plants

A. Protscale工具预测蛋白疏水性; B. MwZFP10 的跨膜结构分析，图中第一条横线(1.0 ～1.2) 表示综合结果;C. MwZFP10 的信号肽预测(C-score 表示剪切位置分值，S-score表示信号肽分值，Y-score 表示综合剪切位置分值); D. MwZFP10 的磷酸化位点预测图4 MwZFP10 蛋白的理化性质分析A. Hydrophobic analysis of MwZFP10 by Protscale; B. Transmembrane analysis of MwZFP10 by TMpredSerer.The first horizontal line(1.0 -1.2) in the graph represents the comprehensive result; C. Signal peptide analysis of MwZFP10 by SignalP4.1 (C-score means cleavage site score, S-score means signal peptide score, Y-score means combined cleavage site score); D. Predicted phosphorylation site for MwZFP10 by NetPhos 3.1 ServerFig.4 Physicochemical properties of MwZFP10

h(Hh).α-螺旋；e(Ee).延伸链；t(Bt).β-转角图5 MwZFP10蛋白的二级结构预测h(Hh) means alpha helix; e(Ee) means extended strand; t(Bt) means beta turnFig.5 Secondary structure prediction of MwZFP10 protein

2.4 MwZFP10组织表达特异性分析

定量分析结果(图7)显示，MwZFP10在红花玉兰花被片、雌蕊、雄蕊、叶片和苞片中均有表达，而且其表达主要集中在雌蕊、叶片和苞片中，表明该基因可能参与了雌蕊、苞片和叶片的发育。

2.5 MwZFP10转基因功能分析

为了进一步分析MwZFP10基因调控花发育的功能，构建了MwZFP10基因正义表达载体，并将其转化拟南芥进行功能分析。经过抗生素(Ka-namycin)筛选和PCR鉴定后，共获得6株35S∷MwZFP10转基因植株，其中6株拟南芥呈现出显著的表型改变。图8显示，与野生型拟南芥相比，过表达MwZFP10基因拟南芥呈现植株矮小，叶片卷缩并极度缩小；同时花序分枝减少，部分花瓣严重缩小，雄蕊数量减少甚至缺失，雌蕊膨大甚至增加至2个，不能正常结实(图8)。

图6 MwZFP10蛋白三级结构预测Fig.6 Tertiary structure prediction of MwZFP10 protein

A. 半定量PCR分析；B.实时荧光定量PCR分析图7 MwZFP10基因的组织表达模式分析A.The semi-quantity PCR analysis; B.Quantitative Real-time PCR analysisFig.7 Tissue expression profile of MwZFP10 gene

A～C.转基因拟南芥花器官；D.野生型拟南芥花器官；E.转基因拟南芥整体植株；F.野生型拟南芥整体植株图8 转MwZFP10基因和野生型拟南芥表型差异分析A-C show the floral organs of transgenic plant; D is the floral organs of the wild-type; E is the plant of the transgenic; F is the plant of the wild-typeFig.8 Phenotypic differences between the positive transgenic Arabidopsis and wild-type

3 讨 论

花器官多样性是红花玉兰最具观赏价值的性状，系统地开展红花玉兰花器官发育相关基因的研究并运用到育种生产实践中，对红花玉兰花型改良与种质创新具有重要的学术意义和应用价值。

SUPERMAN类基因是C2H2家族中的一类编码单锌指蛋白的基因，在植物花发育的过程中起重要作用，该蛋白的共同点是在其N端和C端分别含有一个高度保守的结构域，分别是QALGGH和L/IDLELRLG。不同来源的SUPERMAN类蛋白之间，除了这两个结构域及其附近的碱基序列高度保守之外，其他序列均呈现高度差异，因此它们的生理功能也表现出较大差异。本研究进行序列比对发现MwZFP10蛋白含有SUPERMAN类蛋白特有的N端和C端的保守基序：QALGGH和IDLELRLG。N端的C2H2-type(QALGGH) 锌指结构域及其附近的碱基序列决定与目的基因结合过程中作用，C端的富含亮氨酸的序列为反馈抑制区序列。

半定量RT-PCR分析显示MwZFP10基因在雌蕊、苞片和叶片中呈现高表达，这表明该基因与花器官的发育有密切关系。SUPERMAN类基因广泛参与花器官发育、植株生长、形态建成、激素调控及逆境响应等过程[2-4]。在SUPERMAN基因家族中，除了TAC1以及SAZ外，其他SUPERMAN基因均会影响植物花器官的发育。功能分析显示，过表达MwZFP10基因拟南芥呈现植株矮小，叶片卷缩并极度缩小；同时花序分枝减少，部分花瓣严重缩小，雄蕊数量减少甚至缺失，雌蕊膨大甚至增加至2个，不能正常结实，其表型变化与拟南芥SUP基因的过表达呈现高度相似。过表达拟南芥SUP基因，会导致拟南芥花瓣和雄蕊数量减少，雄蕊甚至全部缺失，雌蕊数量增加[7]。MwZFP10在花器官的雌蕊中表达较高而且过表达拟南芥的雌蕊发育异常出现2个雌蕊，这可能与MwZFP10参与花发育过程中抑制细胞的分化有关，与SUPERMAN基因在拟南芥中调控心皮的形成的作用有一定的相似性。

SUPERMAN类转录因子对植物花发育以及植物的抗逆性产生影响，随着对不同物种的SUPERMAN类基因的研究，其对于植物生长发育的调控机制也会更加清晰。