沙冬青AmFAD7和AmFAD8基因的克隆与转化及其功能初步分析

薛 敏，郭 婷，任美艳，殷玉梅，王茅雁

(内蒙古农业大学 生命科学学院，呼和浩特 010018)

低温、高温和干旱等逆境是影响植物生长发育的主要环境因素。研究表明，细胞膜系统是植物感受低温甚至高温胁迫的原初部位[1-2]。低温胁迫分为冷害(0 ℃以上)和冻害(0 ℃以下)两种。当冷害发生时，细胞膜脂的流动性会趋于降低甚至会损伤膜系统，细胞内蛋白质的合成和酶系统的活性以及基因表达等均会发生改变，从而影响细胞代谢等生命活动过程[3]。冻害来袭时会导致植物细胞严重脱水，甚至会造成细胞内外结冰而使膜系统受到机械损伤，直接导致细胞死亡[4-5]。通常，抗寒性强的植物在低温胁迫下膜脂中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)的含量会升高，从而可降低膜脂的相变温度，利于维持膜的流动性和完整性[6-7]。相反，高温胁迫会引起膜系统由液晶态向液态转变，从而引起膜结构损伤或者解体[8]。此时膜脂中PUFA含量的降低或者脂肪酸饱和度的升高常利于维持膜结构的稳定和增强耐热性。此外，膜脂中PUFA的含量与植物抵抗干旱和盐胁迫等逆境也有密切关系[9]。

植物细胞膜脂中PUFA的组成主要包括二烯酸(C16∶2和C18∶2)和三烯酸(C16∶3和C18∶3)，其中C18∶3和C18∶2在大多数植物的膜脂中含量最为丰富，而且其含量、尤其是C18∶3的相对含量与植物抵抗低温和高温等逆境胁迫关系最为密切[9-10]。C18∶3由一类膜结合型脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase，FAD)在C18∶2的ω-3(Δ-15)位置引入一个双键而生成，这类FAD被称为ω-3 FAD。在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中共有3个ω-3 FAD编码基因，即AtFAD3、AtFAD7和AtFAD8。其中前者编码产物分布于内质网膜上，而后两者编码产物均定位于质体/叶绿体被膜中[11-13]。这些基因以及它们在水稻(Oryzasativa)、番茄(Solanumlycopersicum)和大豆(Glycinemax)等植物中的同源基因已被克隆，其中FAD7和FAD8型基因在抵抗低温和干旱等非生物胁迫中的作用已基本得到证实[14-16]。将拟南芥AtFAD7和AtFAD8在烟草中超表达，可以增加转基因株系中三烯酸的含量并能分别提高其耐冷性和抗旱性，但却降低了其耐热性[17-19]。番茄LeFAD7和水稻OsFAD8也具有类似的功能[14-15]。在有些植物中FAD7和FAD8的编码基因成对存在甚至数目更多，这些基因在响应逆境胁迫上存在差异。例如，马齿苋(Portulacaoleracea)PoleFAD7和陆地棉(Gossypiumhirsutum)GhiFAD7/8-1均受低温胁迫的诱导，而这些植物的PoleFAD8以及GhiFAD7/8-2和GhiFAD7/8-3却对低温胁迫无响应[20]。这些研究结果表明FAD7和FAD8在植物抗逆性中起重要作用，而且来自不同植物或同一种植物的同源基因在功能上可能存在分化[21]。

蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)为古老的珍稀濒危常绿阔叶灌木，为豆科沙冬青属仅有的两个种之一。由于长期生存于冬寒夏热、常年干燥缺水和土壤沙化贫瘠的蒙古高原寒旱荒漠区，该物种形成了极强的抗寒、抗旱和耐热、耐盐碱等抗逆特性，成为不可多得的研究植物抗逆性和挖掘抗逆基因的好材料[22]。前期通过对该物种进行转录组分析，获得了AmFAD7和AmFAD8 的cDNA序列以及二者的寒旱胁迫RNA-Seq表达谱[23]。本研究利用半定量RT-PCR方法分析了这2个基因在低温、高温和干燥胁迫处理2～48 h以及它们在野外不同季节复合逆境下的表达变化。此外，克隆到2个基因并转化拟南芥，测定了AmFAD7转基因株系在低温和高温胁迫处理后细胞膜透性的变化，为深入研究其功能奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 沙冬青胁迫处理与取样

采用沙培法将蒙古沙冬青幼苗培养1月，进行下述胁迫处理。

(1)低温处理。将幼苗放入低温光照培养箱(Percival LT-36VL，Percival，USA)中进行梯度降温处理，即4 ℃ 21 h，-2 ℃ 8 h，-6 ℃ 19 h，共48 h；分别在处理前(0 h)和处理后2、6、12、24和48 h取幼苗并用预冷的自来水漂洗干净、冻存。

(2)高温处理。将幼苗放入42℃电热干燥箱中，期间补充水分，取样时间点同低温处理，将幼苗用预热的自来水漂洗干净、冻存。

(3)干燥处理。将幼苗从沙土盆中取出并用自来水漂洗干净，放在滤纸上于25 ℃、弱光照下进行自然干燥，取样时间点同低温处理。

不同季节野外取样于2015年7月至2016年5月进行，于每个月初上午从野外生长植株(呼和浩特市南郊蒙草抗旱公司野生植物园区)上剪取嫩叶作为样品，液氮中速冻后保存于-76 ℃。

1.2 方 法

1.2.1半定量RT-PCR分析利用改进的Trizol法从冻存样品中提取总RNA[24]，再用RNase-Free DNaseⅠ(Promega公司)进行纯化，然后用M-MLV逆转录酶(Takara公司)将其反转录合成cDNA第一链。以蒙古沙冬青AmActin作为内参基因，对不同样品的cDNA模板量进行均一化，分别用AmFAD7和AmFAD8表达引物(表1)进行半定量RT-PCR分析。15 μL反应体系中含：10×PCR缓冲液1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.2 μL，上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)，cDNA模板X μL，rTaq酶(5 U/μL)0.15 μL，剩余体积用ddH2O补足。PCR程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，32个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。每个样品至少进行3次独立PCR实验。

前两次的被捕都只是被短期拘留之后就被释放了出来，然而1930年5月又一次被逮捕，只是这次不像前两次很快就被释放了出来，中野重治在监狱里待到同年12月，直至被保释出狱。以这次八个月左右的入狱经历为素材，中野重治于次年1931年6月在杂志《改造》上发表了短篇小说《菊花》。

1.2.23′-RACE与基因克隆利用Takara公司的3′-RACE试剂盒扩增AmFAD7 cDNA序列的3′端，所用引物见表1。将所得3′端序列与原序列进行拼接获得全长cDNA序列。然后在AmFAD7和AmFAD8编码区两侧设计引物(表1)，以上述cDNA做模板，用Fast Pfu DNA聚合酶(Trans公司)进行PCR扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带，然后与pEASY-Simple-Blunt克隆载体(Trans公司)连接。将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)TOP10感受态细胞，单菌落经PCR检测为阳性者送北京华大基因公司测序。

1.2.3蛋白序列分析与进化树构建用ProParam软件分析蛋白质疏水性；用TMHMM Serverv2.0软件预测蛋白跨膜区；用TargetP1.1 Server和ChloroP 1.1 Server软件预测叶绿体导肽；用Clustal X和GeneDoc程序进行蛋白多序列比对，均采用默认参数；用MEGA 7.0软件通过邻接法(Neighbor-Joining, NJ)构建进化树，采用1 000次Bootstrap进行分析。

1.2.4植物表达载体构建从含有AmFAD7和AmFAD8克隆载体以及植物表达空载体pCAMBIA3300-35ST(p3300-35ST)的E.coli菌液中提取质粒DNA(天根公司质粒DNA提取试剂盒)，分别用BamHⅠ/SmaⅠ和XbaⅠ/SmaⅠ进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳及目的基因片段与载体片段的回收。再用T4DNA连接酶将二者连接并转化E.coliTOP10感受态细胞，将单克隆进行菌落PCR检测和质粒DNA酶切鉴定。将构建好的重组表达载体通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101 感受态细胞，经菌落PCR检测获得阳性克隆，冻存。

1.2.5转基因拟南芥的获得和电导率测定用常规方法培养野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)至4周龄，同时将冻存的农杆菌激活培养并通过沾花法转化拟南芥。收取转化植株的种子(T1代)播种于营养钵中，培养3周后用0.5‰草丁膦(phosphinothricin，PPT)溶液每天喷雾1次，连续喷雾3 d。取存活植株叶片用SDS法提取基因组DNA做模板，用基因编码区特异性引物(表1)进行PCR检测。将阳性植株单株收种获得T2代种子，然后点种于含6.5 mg/L PPT 1/2 MS 固体培养基上培养，筛选白苗与绿苗接近1:3的株系用半定量RT-PCR方法分析目的基因表达量(以拟南芥AtActin作为内参基因，引物见表1)。选择AmFAD7和AmFAD8表达量较高的株系繁殖T3代，然后在含PPT的筛选培养基(同T2代)上筛选全部为绿苗的纯合体用于抗逆性鉴定实验。

表1 实验所用引物

注： *下划线部分为酶切位点

Note: *Underlined sequences are recognized sites of the restriction enzymes

电导率测定是将野生型(WT)和转基因拟南芥在正常条件下培养至4周龄，然后分别置于-1 ℃和37 ℃下处理24 h，期间给予16 h弱光照和8 h黑暗的光照条件。称取待测样品叶片各0.2 g，按照赵世杰[25]的方法测定相对电导率并计算膜的伤害度。

相对电导率(%)=(L1-L0)/(L2-L0)×100%

其中L0为空白(去离子水)对照，L1和L2分别为初始电导率和最终电导率。

2 结果与分析

2.1 AmFAD7和AmFAD8的表达分析

2.1.12个基因的RNA-Seq表达谱在前期通过对蒙古沙冬青进行转录组测序和表达谱分析，获得了2个受低温和干燥胁迫诱导的质体型ω-3 FAD cDNA序列[23]。根据基因注释信息，它们分别与拟南芥和大豆的质体型FAD7和FAD8有较高相似性，故此暂将其命名为AmFAD7和AmFAD8。二者的RNA-Seq表达谱数据为：在正常生长条件下(CK，对照)，AmFAD7在蒙古沙冬青幼苗中表达量很低，其RPKM(reads per kilobase per million reads)值为0.8，而AmFAD8表达量较高，其RPKM值为73.8；在低温处理2 、8和24 h后，AmFAD7的表达量分别增加到对照的6.5、12.1和7.4倍，而AmFAD8则呈现先降低后升高的变化趋势，其表达变化幅度仅为对照的0.8～2.1倍；在干燥胁迫2、8和24 h后，AmFAD7的表达量分别为对照的155.2、25.1和2.4倍，而AmFAD8一直呈降低趋势(图1)。这些数据表明AmFAD7在转录水平受低温和干燥胁迫的显著诱导，而AmFAD8的转录受低温胁迫轻微诱导但被干燥失水明显抑制。

2.1.2不同胁迫处理下2个基因的半定量RT-PCR分析为了深入了解AmFAD7和AmFAD8对低温、高温和干燥胁迫的响应，利用半定量RT-PCR方法分析了它们在胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的表达变化。结果如图2所示。在胁迫处理前正常条件下(0 h，对照)，2个基因均有较高水平的基础表达，其中AmFAD8表达量略高于AmFAD7。在低温处理2 h后，AmFAD7的表达量略有降低，但在处理6～48 h期间逐渐升高；AmFAD8的表达量在此期间也比处理前略有增加。在高温处理2～48 h期间，2个基因的表达量均趋于降低，尤其AmFAD7降低较为迅速。在干燥胁迫2～48 h期间，AmFAD7的表达量有较明显的升高，而AmFAD8在处理2和6 h后略有降低，在处理12～48 h期间略有回升(图2)。这一结果表明AmFAD7和AmFAD8对低温、高温和干燥胁迫的响应存在差异。总体而言，AmFAD7对这3种胁迫的响应较为明显，而AmFAD8的响应则相对较弱。

CK为正常生长条件；C2、C8、C24和 D2、D8、D24分别为低温和干燥处理2、8和24 h图1 AmFAD7和AmFAD8在低温和干燥胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的RNA-Seq表达谱CK. Normal growth conditions; C2, C8, C24 and D2, D8, D24. 2, 8 and 24 h after cold and dehydration treatments, respectivelyFig.1 The RNA-Seq expression profiles of AmFAD7 and AmFAD8 in the cold-or dehydration-stressed A.mongolicus seedlings

图2 AmFAD7和AmFAD8在不同胁迫处理的蒙古沙冬青幼苗中的表达变化Fig.2 Expression changes of AmFAD7 and AmFAD8 in the A. mongolicus seedlings under different stress treatments

2.1.3不同季节野外自然条件下2个基因的表达变化基因在野外条件下的表达变化更能反映其响应复杂自然环境的真实情况，为此本研究利用半定量RT-PCR方法对AmFAD7和AmFAD8在不同季节野外生长的蒙古沙冬青嫩叶中的表达变化进行了分析。结果表明，在夏季(7月)天气较炎热时，AmFAD7有少量表达，而AmFAD8表达水平较高；在进入秋季后(9～11月)，随着天气变得冷凉，2个基因的表达量均明显升高，尤其AmFAD7在11月初升高更为明显；在进入初冬，即12月初时，2个基因的表达量均无明显变化，但在进入翌年1月份更寒冷时期，AmFAD7的表达量进一步升高，而AmFAD8的表达量则明显降低；随着春季到来(3～5月)，AmFAD7的表达量呈现先降低后回升的变化趋势，但均低于其在1月份的表达水平，而AmFAD8的变化趋势正好相反(图3)。 总体来看，AmFAD7的转录水平与一年四季温度的变化基本呈负相关，而AmFAD8的转录水平在秋季和春季总体上高于夏季和冬季(图3)。

2.2 AmFAD7和AmFAD8 cDNA的克隆及其蛋白基本特征分析

2.2.12个基因编码区cDNA的克隆在转录组测序中获得的AmFAD7和AmFAD8 cDNA序列长分别为900和1 872 bp。通过Omiga软件分析并在GenBank中进行同源比对，发现AmFAD7序列的编码区在3′端不完整，而AmFAD8为编码区完整的全长序列。为此首先对AmFAD7进行了3′-RACE，获得一条1 346 bp序列(图4，A)。将该序列与原序列进行拼接，获得全长为2 187 bp的序列，它含有1 368 bp完整编码区和474 bp的5′-UTR与345 bp的3′-UTR。AmFAD8 全长cDNA序列中含有一个1 374 bp完整编码区和399 bp 5′-UTR与99 bp 3′UTR序列。分别在2个基因的UTR区设计引物，以蒙古沙冬青叶片的cDNA作模板进行PCR扩增，均获得预期大小的扩增片段(图4，B、C)。将这些片段分别与克隆载体连接后转化E.coli，然后进行菌落PCR检测并将阳性克隆进行测序，证明获得了正确的编码区片段。

图3 AmFAD7和AmFAD8在不同季节野外生长的蒙古沙冬青嫩叶中的表达变化Fig.3 Expression changes of AmFAD7 and AmFAD8 in young leaves of the A. mongolicus plants growing in the wild in different seasons

2.2.22个基因蛋白基本特征分析AmFAD7编码蛋白含455个氨基酸残基，相对分子质量为51.76 kD，等电点为7.84。AmFAD8编码蛋白含457个氨基酸残基，相对分子质量为52.32 kD，等电点为9.29。它们彼此间的相似性为84%。此外，AmFAD7和AmFAD8均有3个跨膜结构域，分别位于AmFAD7的139～161、288～310和317～339位以及AmFAD8的137～159、286～305和312～334位；在其N末端还分别具有由76和27个氨基酸残基组成的叶绿体导肽序列。将AmFAD7和AmFAD8与拟南芥和大豆的FAD7与FAD8蛋白进行序列比对，发现在AmFAD7的174～178、210～214和377～381位分别存在3个FAD家族酶活性所必须的保守组氨酸簇HXXXH、HXXHH和HXXHH。在AmFAD8的相应位置也存在这些保守序列(图5)。这些序列特征表明AmFAD7和AmFAD8编码蛋白具备拟南芥和大豆FAD7和FAD8的共有特征，属于这些物种FAD7和FAD8在蒙古沙冬青中的同源基因。

将AmFAD7和AmFAD8与拟南芥、大豆、油菜和播娘蒿的ω-3 FAD蛋白序列构建进化树，结果表明AmFAD7和AmFAD8与这些植物的质体型FAD7和FAD8聚在一类，而所有内质网型ω-3 FAD，即FAD3聚在另一类。在质体型ω-3 FAD中，AmFAD7和AmFAD8分别与大豆GmFAD7-1/-2和GmFAD8-1/-2距离更近，而与拟南芥、油菜和播娘蒿的FAD7和FAD8距离较远(图6)。这与蒙古沙冬青与大豆在转录组水平上亲缘关系最近的结果相一致。

A. AmFAD7 3′RACE图谱；B和C. AmFAD7和AmFAD8编码区扩增图谱；1.扩增产物；M.Trans2K Plus DNA Marker图4 AmFAD7和AmFAD8编码区PCR扩增图谱A. AmFAD7 3′RACE pattern; B and C. Amplification patterns of AmFAD7 and AmFAD8 coding regions, respectively. 1. PCR products; M. Trans2K Plus DNA MarkerFig.4 Amplification patterns of the AmFAD7 and AmFAD8 coding regions by PCR

AtFAD7和AtFAD8.拟南芥(NP＿187727和NP＿196177)；GmFAD7-1和GmFAD8-1.大豆(ACS15381和NP＿001238609)；▲代表组氨酸簇图5 AmFAD7和AmFAD8与拟南芥和大豆FAD7与FAD8的序列比对AtFAD7 and AtFAD8. Arabidopsis thaliana(NP＿187727 and NP＿196177);GmFAD7-1 and GmFAD8-1.Glycine max(ACS15381 and NP＿001238609);▲ represents the histidine clustersFig.5 Sequence alignments of AmFAD7 and AmFAD8 with the FAD7s and FAD8s from Arabidopsis and soybean

图6 AmFAD7和AmFAD8与其他植物ω-3 FAD蛋白的进化树Fig.6 Phylogenetic tree of AmFAD7 and AmFAD8 with the ω-3 FADs from other plants

A和B. AmFAD7和AmFAD8菌落PCR； C和D. AmFAD7和AmFAD8质粒酶切鉴定；1～4. 产物；M1. Trans2K Plus；M2. D15000+2000图7 AmFAD7和AmFAD8植物表达载体构建鉴定图谱A and B. Colony PCR of AmFAD7 and AmFAD8, respectively; C and D. Restriction analysis pattern of AmFAD7 and AmFAD8, respectively; 1-4. Product; M1. Trans2K Plus；M2. D15000+2000Fig.7 Confirmation of AmFAD7 and AmFAD8 plant expression vector constructions by colony PCR and restriction analysis

2.3 AmFAD7和AmFAD8植物表达载体构建

利用定向克隆的方法将AmFAD7和AmFAD8编码区cDNA片段分别连接到植物表达载体p3300-35ST的35S启动子下游，然后转化E.coli。对转化后产生的E.coli单克隆进行菌落PCR检测和质粒酶切鉴定，均获得预期大小的目的片段(图7)，表明载体构建成功。将它们分别命名为p3300-35S-AmFAD7和p3300-35S-AmFAD8。

2.4 AmFAD7和AmFAD8转基因拟南芥的获得与电导率测定

用上述构建好的表达载体分别转化农杆菌并进行菌落PCR检测获得阳性克隆。然后用农杆菌介导法分别转化拟南芥WT，获得了T1代种子。将T1代幼苗用除草剂PPT进行筛选，2个基因分别得到18株(AmFAD7)和16株(AmFAD8)抗性植株。从抗性植株和WT中提取基因组DNA进行PCR检测，结果在抗性植株中均检测到AmFAD7或AmFAD8的扩增条带，而对照WT中未检测到任何条带(图8)，表明2个基因已分别整合到抗性植株基因组中。在T2代用半定量RT-PCR方法分别对这2个基因的5个转基因株系(PPT抗性绿苗与白苗比例接近3∶1)进行表达分析，结果表明在F7-1和F7-2以及F8-1～ F8-4株系中目的基因的表达量均高于其余株系(图9)。从这些高表达株系的T3代中进一步筛选纯合体(全部为PPT抗性绿苗)用于抗逆性鉴定。

相对电导率是衡量逆境胁迫下植物细胞膜稳定性及其伤害程度的重要指标，为此对AmFAD7转基因株系(F7-1和F7-2)和WT在低温(-1 ℃)与高温(37 ℃)胁迫处理前后的相对电导率进行了测定。结果表明，在处理前正常生长条件(22 ℃)下，转基因株系与WT此值间无明显差异(21.1%～22.1%)，但在温度胁迫处理24 h后，其相对电导率的变化却与WT明显不同。在低温处理后，F7-1和F7-2的相对电导率分别为32.8%和36.1%，均显著低于WT的48.5%；在高温处理后，F7-1和F7-2的相对电导率分别为44.7%和41.9%，均显著高于WT的33.2%(图10，A)。进一步计算膜的伤害度，在低温胁迫下 F7-1和F7-2株系分别为14.8%和17.9%，均显著低于WT(34.3%)，而在高温胁迫下，二者的伤害度分别为29.9%和25.4%，均显著高于WT(14.7%；图10，B)。结果表明，转基因植株的细胞膜在低温胁迫下受到较低伤害，其耐冻性增加；而在高温胁迫下细胞膜损伤程度比野生型严重，其耐热性降低。

A和B. AmFAD7和AmFAD8的PCR检测；M1. Trans2K Plus；F. PPT抗性植株；WT. 野生型图8 AmFAD7和AmFAD8在部分T1代转化植株中的PCR检测图谱A and B. Detection of AmFAD7 and AmFAD8 by PCR; M. Trans2K Plus DNA Marker; F. The PPT-resistant plants; WT. Wild typeFig.8 Detection of AmFAD7 and AmFAD8 in some transformed T1 Arabidopsis plants by PCR

A和B. AmFAD7和AmFAD8的RT-PCR检测；1～5. 转基因株系；WT. 野生型图9 AmFAD7和AmFAD8转录本在T2代转基因株系中的RT-PCR检测图谱A and B. Detection of the AmFAD7 and AmFAD8 transcripts by RT-PCR; 1～5. the transgenic lines; WT. wild typeFig.9 Detection of the AmFAD7 and AmFAD8 transcripts in the T2 transgenic lines by RT-PCR

*和**分别表示在0.05 和0.01 水平上转基因株系与WT的差异显著性图10 温度胁迫对转AmFAD7基因拟南芥叶片相对电导率(A)和伤害度(B)的影响* and ** represent significantly different from the control WT at 0.05 and 0.01 levels, respectivelyFig.10 Effect of temperature on relative electronic conductance (A) and extent of injury (B) in AmFAD7 transgenic Arabidopsis

3 讨 论

膜脂是构成细胞膜系统的基本骨架，因此其组成直接影响膜的流动性与稳定性。PUFA，尤其C18∶3和C18∶2是大多数植物细胞膜脂中含量最多的组分，因此其含量被认为与膜系统的流动性等物理性状关系最为密切，从而影响植物对低温和高温等非生物胁迫的抗性[8]。由于类囊体膜中的C18∶3在植物耐低温胁迫中起重要作用，而其中绝大多数是由叶绿体被膜上的FAD7和FAD8催化形成，故此对于FAD7和FAD8的研究备受关注。这类FAD由核基因编码且在不同植物中高度保守。其典型特征是含有3个非常保守的组氨酸簇，它们为FAD家族酶活性所必须。此外在其N末端还具有一个导肽序列，负责引导这些蛋白分子向叶绿体转运并插入叶绿体被膜中[26-27]。本研究克隆的2个FAD基因的编码蛋白均含有这些保守序列，表明它们具备质体型ω-3 FAD行使功能的基本结构基础。

虽然从不同植物克隆的FAD7和FAD8在序列上高度保守，但它们在响应和抵抗低温与高温等非生物胁迫中的表现与作用存在差异。拟南芥AtFAD7的表达被低温抑制，而其AtFAD8的表达则受低温诱导；在二者的双突变体(fad7fad8)中三烯酸含量比野生型明显降低，伴随着出现其耐热性比野生型增强[10,28]。最近发现这2个基因的编码产物在不同温度条件下以非冗余协同作用的方式参与三烯酸的合成，它们在底物选择的偏好性上也存在差异[29]。大豆的2对质体型FAD基因也表现出不同的胁迫响应模式：GmFAD7-1和GmFAD8-1/8-2对低温胁迫无响应，而GmFAD7-2却受低温胁迫的显著诱导[16]。低温胁迫下红花(Carthamustinctorius)叶片中CtFAD7的转录水平略有升高，而其CtFAD8则明显降低[30]。与之相反，低温胁迫下播娘蒿DsFAD7的转录水平趋于降低，而其DsFAD8的转录水平则趋于升高[31]。基于RNA-Seq表达谱数据和对室内幼苗的半定量RT-PCR分析结果，可见AmFAD7和AmFAD8在响应低温、高温和干燥胁迫中起重要作用，尤其AmFAD7受这3种胁迫的诱导幅度要比AmFAD8明显。在野外高温低温和干旱缺水等复合逆境条件下，二者的表达变化趋势也明显不同，反映出AmFAD7和AmFAD8虽然均为质体型同工酶，但它们在响应逆境中可能起着不同的作用。

研究表明，植物细胞膜脂中脂肪酸的不饱和程度是决定膜相变温度的关键因素，通常脂肪酸不饱和度的增加可降低膜的相变温度，有利于提高膜在低温下的稳定性并维持其正常功能，从而避免因膜脂固化造成的膜系统损伤。将拟南芥的AtFAD7和AtFAD8分别导入烟草和水稻中，转基因植株三稀酸含量增加并表现出较强的低温抗性[14,17]。在番茄中过表达LeFAD3，可增加低温下转基因番茄中C18∶3的含量，而其相对电导率和呼吸速率的增加值却小于对照植株，表明其低温抗性提高[32]。本研究发现，低温胁迫下AmFAD7转基因植株相对电导率增幅较小，膜受到损伤的程度较轻，表明组成型表达AmFAD7增强了转基因植株在低温胁迫下细胞膜的稳定性及其耐冻性。另一方面，膜脂脂肪酸不饱和度的增加不利于维持细胞膜系统在高温胁迫下的稳定性，从而降低植物的耐热性[33]。如在烟草中过表达FAD3和FAD8可增加三稀酸含量，但转基因幼苗的耐热性明显下降；拟南芥fad7fad8突变体中三稀酸含量下降，伴随出现植株耐热性的提高[10,19]。本研究也发现，组成型表达AmFAD7加重了转基因拟南芥在高温胁迫下细胞膜的损伤程度，降低了其耐热性。可见，FAD基因在调节细胞膜脂组成和植物抵抗低温高温以及其他逆境胁迫中的作用较为复杂，可能具有双效甚至多效性。本研究所克隆的AmFAD7和AmFAD8在抵抗温度胁迫以及其他逆境中的确切功能以及作用机理还需进一步深入研究。