密闭式体外培养系统对胚胎发育及小鼠学习和记忆能力的影响

颜晓红，李友筑，周卫东，林莉，吴荣锋，陶萍，余裕炉

(厦门大学附属第一医院生殖医学中心，厦门 361003)

胚胎体外培养是体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的关键技术，为了减少开放式培养体系中CO2培养箱内及室外环境剧烈变化对胚胎造成伤害，增加CO2培养箱数目、安装复合式玻璃小门以减小开门次数和面积以保持胚胎培养环境的稳定性是目前可行的主要措施，但其代价十分昂贵，且可靠性也有待商榷[1-2]。近年来，因大气污染导致人类生育功能下降的报道时有发生[3]。1988年Ranoux等[4]首次将人类卵子与精子密封于塑料冷冻管中，置受试者的阴道内培养48～52 h，将发育到4-细胞期的胚胎植入子宫后获得了正常妊娠和分娩，但仍与空气相接触，其效果与常规开放式培养相同。本研究通过在小鼠胚胎中进一步探索密闭培养系统的可靠性，试图建立新的胚胎体外培养体系。

材料与方法

一、研究对象

实验所用SPF级昆明小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。雄鼠4只，8周龄，体重大于25 g；雌鼠16只，8周龄，体重大于20 g。小鼠在室温22～25℃、湿度40%～60%、光照交替(14 h光照、10 h黑暗)的SPF条件下喂养。实验前4 d，雌性昆明小鼠腹腔注射10 U的孕马血清促性腺激素(PMSG)，48 h后腹腔注射10 U人绒毛膜促性腺激素(HCG)。将注射了HCG的雌鼠与雄性昆明小鼠进行交配，交配成功以阴道栓的有无来判断。

二、主要试剂和仪器

1.主要试剂：PMSG、HCG均购自宁波激素制品厂；配子处理、胚胎操作以及胚胎培养等相关试剂均为瑞典Vitrolife公司产品。

2.主要仪器：解剖显微镜、倒置显微镜和相差显微镜(Olympus，美国)；CO2培养箱、离心机和超低温冰箱(Thermo，美国)；台式高压锅(山东新华医疗)，电热恒温水浴箱(为上海精宏实验设备)，DT-200小鼠跳台测试箱、水迷宫(成都泰盟科技)。密闭培养设备为本院自己设计制造并获国家发明专利(专利号：ZL 2016 1 0707688.6)。

三、小鼠卵母细胞的收集与胚胎体外培养

颈椎脱臼法处死超排卵母鼠，取出卵巢、输卵管和子宫，在实体解剖镜下，用眼科镊子撕开输卵管伞，用安装有4号针头(已断尖)的注射器抽取1～2 ml已预温的G-MOPS液冲洗输卵管与子宫，收集各发育阶段的卵与胚胎。为了观察所取卵母细胞情况，用0.1%透明质酸酶去除卵母细胞周围的卵丘细胞后，直接在实体解剖镜或倒置显微镜下计数和观察；为了观察卵母细胞的受精和发育情况，则采用0.1%透明质酸酶去除其周围的卵丘细胞后，经G-IVF-plus洗3次，移入G-1-plus培养滴中(20～30枚/50 μl)，覆盖矿物油，在37℃、5% CO2、饱和湿度的条件下，置CO2箱中培养12～24 h；2-细胞胚胎自输卵管或子宫冲出后，在倒置显微镜下观察与记录，以备小鼠胚胎移植与着床点观察。

四、胚胎密闭培养

本研究所用密闭培养设备如图1所示。将该装置预先放入Thermo 3111培养箱中(37℃、6% CO2、饱和湿度)并旋开盖子于通气状态(图1A、1C)下备用。胚胎培养采用3001培养皿制备微滴进行培养，方法同常规培养。将培养皿放入密闭培养装置中(图1B、1D)，盖上盖子但不密封，使设备处于通气状态，在培养箱中平衡30 min，随后盖紧盖子使设备处于密封状态置于培养箱中培养36 h，然后换囊胚培养液继续密闭培养24 h。

A.密闭培养设备外观图；B.内部结构图；C.通气孔；D.密封圈图1 胚胎密闭式培养设备图

常规培养组(对照组)中，胚胎采用常规方法培养，培养皿置于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下的CO2箱中培养；囊胚培养时放入低氧的三气培养箱中培养。

本研究中，根据G系列培养液说明书要求的时间进行换液。两组研究中，卵裂胚采用G1-plus培养液进行培养，囊胚采用G2-plus培养液进行培养。

五、小鼠胚胎移植与着床点观察

1.小鼠胚胎移植：收集小鼠2-细胞胚胎，分成密闭培养组和对照组，分别体外培养至囊胚期以供移植。采用子宫内移植的手术方法进行移植，受体鼠每侧子宫移植7～8个胚胎，操作后在解剖显微镜下检查移植管中有无余留胚胎。移植结束，复位缝合。为确定移入胚胎的分布，在移入后的第10天打开腹腔检查移植胚胎的植入情况。

2.小鼠胚胎着床点观察：根据小鼠胚胎发育时程，在所需胚胎着床的时间尾静脉注射0.4%台盼蓝，其后颈椎脱臼处死小鼠，从腹部打开，取出完整的卵巢和子宫，进行拍照。

六、Morris水迷宫实验

水迷宫主要由一圆柱型水池和一可移动位置的站台组成。水池高70 cm，直径80 cm，站台直径8 cm，水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。预先在水池中注入清水，水深15 cm，加入炭素墨水使池水变为不透明的黑色，站台表面为黑色，使小鼠不能看到，水面高出站台表面0.5 cm。水温控制在(22±0.5)℃，在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。站台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保持站台位置不变。每次实验以120 s为限，纪录动物从入水点到达站台所需时间以及在这段时间内的游泳路程和速度，以所需时间作为学习和记忆成绩，若设定时间内未找到站台，计算机停止跟踪，记录时间为120 s。每次实验在隔音的房间内进行，水池、光源、鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。经3 d训练，若小鼠在120 s内找到站台，让其在站台上停留20 s，若小鼠未找到站台，将其放在站台上使其停留20 s。于第4天、第5天、第7天和第11天进行4个阶段的Morris水迷宫学习和测试。

七、小鼠跳台实验

打开DT-200小鼠跳台测试箱，将参加实验的各组小鼠先放入反应箱铜栅处自由活动3 min，熟悉实验环境。然后通以32 V交流电，设置实验时间为5 min，小鼠受到电击后将寻找跳台以躲避电击。实验时将实验鼠直接放上跳台，记录各组小鼠第一次跳下平台的时间(潜伏期)和10 min内从跳台跳下的错误次数(记作错误次数)。测验时若小鼠停留在平台的时间超过10 min，其潜伏期以10 min计。连续训练4 d，每天1次。每次进行跳台实验时，要求试验环境，各种参照物保持一致，而且保持安静、空气清新及水温恒定。

八、统计学分析

本研究相关数据采用SPSS 16.0软件进行分析。统计数据以(±s)表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、密闭培养对昆明小鼠胚胎发育与着床的影响

收集小鼠2-细胞胚胎，分成密闭培养组和对照组，分别体外培养至囊胚期以供移植。受体鼠每侧子宫7～8个胚胎，胚胎移植后第10天解剖检查胚胎植入情况。研究结果显示，在密闭培养组(n=8)中共有6只小鼠受孕，受孕率为75%，对照组(n=7)中共有5只小鼠受孕，受孕率为71.43%，两组间无显著差异(P>0.05)；对于囊胚植入情况，在密闭培养组中移植120个囊胚，囊胚植入率为59.17%，对照组中移植105个胚胎，囊胚植入率为57.14%，两组间无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组培养方式对小鼠胚胎发育和着床的影响

另外，我们根据小鼠胚胎发育时程，在所需胚胎定位的时间尾静脉注射台盼蓝，观察移植胚胎着床数和着床点。结果显示，密闭培养组胚胎着床数与对照组无统计学差异(P>0.05)(图2)。以上结果提示，密闭培养体系中小鼠胚胎具有良好的发育潜能，该体系能够支持小鼠早期胚胎在密闭培养条件下正常发育。

二、密闭培养的胚胎移植后对新生小鼠学习与记忆能力的影响

Morris水迷宫实验是学习与记忆研究的经典实验。本研究采用Morris水迷宫实验研究密闭培养胚胎移植后对新生小鼠学习与记忆能力的影响，结果显示，密闭培养组第1～4阶段水迷宫定位航行时间较对照组均无显著差异(P>0.05)(表2)。跳台实验也是检测动物学习与记忆能力的常用方法。本研究采用小鼠跳台实验研究密闭培养胚胎移植后对新生小鼠学习与记忆能力的影响，结果显示与对照组相比，密闭培养组的潜伏期与错误次数均无显著差异(P>0.05)(表3)。以上结果提示，密闭培养的胚胎移植后对新生小鼠学习能力没有显著影响。

A：对照组(左：阴性对照组；右：移植组)，B：密闭培养组(左：阴性对照组；右：移植组)图2 小鼠胚胎移植着床点

组 别只数定位航行用时(s)第4天第5天第7天第11天对照组 2017.224±7.83116.534±8.23615.853±9.20113.936±7.279密闭培养组2018.673±5.83416.908±4.28415.936±5.38317.538±9.627

表3 新生小鼠跳台实验结果(x-±s)

讨 论

在辅助生殖技术中，早期胚胎体外培养是IVF-ET的关键环节[5]。近年来，随着早期胚胎体外培养体系的不断改进与完善，研究者们逐渐将目光集中在早期胚胎体外发育的培养环境上[6]。由于近年来大气环境的污染，导致人类生育功能受到影响[3，7]。在IVF-ET中，早期胚胎培养过程中容易受到包括室内外气体变化及波动的影响，因此室内外及培养箱中的气体质量及稳定性对胚胎发育至关重要，如何有效降低气体对胚胎发育的影响也成了人们关注的热点[8-9]。密闭培养系统是一个与外界环境隔离的培养系统，其优点在于可有效避免外界环境波动对胚胎的影响[10]。本研究通过在小鼠胚胎中探索密闭培养系统的可靠性及其对胚胎发育潜能的影响。

本研究发现，在密闭胚胎培养体系中培养的小鼠胚胎具有较好的受孕率(75.00%)和囊胚植入率(59.17%)，与正常对照组相比均无显著差异(P>0.05)。这提示在密闭培养体系中小鼠胚胎具有良好的发育潜能。

Morris水迷宫实验是1981年由英国心理学家Richard G Morris建立的，主要用于研究实验动物的空间学习记忆能力[11-12]。此后，Morris水迷宫实验被不断地完善和改进，逐渐成为研究学习与记忆最常用的实验方法之一，目前已被广泛应用于和空间学习记忆相关的药理学、毒理学、药剂学、行为生物学等多个学科或领域的科学研究[13-14]。本研究采用Morris水迷宫实验研究密闭培养体系的胚胎移植后对新生小鼠学习和记忆能力，结果显示，密闭培养组第1～4天水迷宫定位航行时间较对照组均无显著差异(P>0.05)，提示本密闭体系培养的胚胎移植后新生小鼠学习记忆能力没有受到明显影响。小鼠跳台实验也是一种常用的评价小鼠学习记忆能力的方法，能较客观地反映动物经过一次刺激后记忆获得的情况[15-16]。本研究通过小鼠跳台实验研究密闭培养胚胎移植后对新生小鼠学习和记忆能力的影响，结果显示，与对照组相比，密闭培养组的潜伏期与错误次数均无显著差异(P>0.05)。

综上所述，密闭培养体系培养的胚胎与常规培养得到的胚胎相比，在胚胎质量和着床上并无明显差异，且对其子代小鼠学习与记忆能力也没有明显影响，提示胚胎密闭培养体系方法操作简单、结果安全可靠且成本较低，具有较大的发展潜力，值得进一步的深入研究。