高通量测序技术进行流产组织染色体拷贝数检测的结果分析

张钏，郝胜菊*，张庆华，冯暄，林晓娟，刘芙蓉，周秉博，闫有圣

(1.甘肃省妇幼保健院，甘肃省出生缺陷防控研究重点实验室，兰州 730050；2.国家卫生计生委科学技术研究所，北京 100081)

自然流产是指妊娠不满28周、胎儿体重不足1 000 g，妊娠自行终止；妊娠12周之内终止称为早期流产。自然流产的发生率为15%～40%，而其中80%以上为发生在12周内的早期流产[1]。临床上，胚胎或胎儿已经死亡，却一直滞留于宫腔内不排出，称为稽留流产[2]。自然流产的病因十分复杂，孕早期的流产原因中，约有60%为胚胎染色体异常引起[2]。目前，对流产绒毛进行核型分析，是检测染色体异常的重要方法。但绒毛细胞采样及培养要求高，培养成功率低，分辨率也低，难以得到满意的结果[3-5]。本研究通过高通量测序进行染色体 DNA 拷贝数(Genomic copy number variations，CNVs)检测和常规染色体核型来进行流产原因分析，探讨高通量测序技术在流产染色体检测中的应用价值。

资料方法

一、资料来源

收集2015年11月至2017年11月在甘肃省妇幼保健院产科门诊确诊的自然流产、稽留流产组织以及绒毛组织，共计266例。患者年龄介于14～43岁，胚胎停育孕周介于孕4～26 周之间，自然流产患者样本190例、稽留流产组织40例、绒毛组织36例。流产(或引产)前B超检查均提示胚胎(胎儿)停止发育或有严重畸形，所有标本均在患者知情同意的原则下采集，然后进行绒毛细胞培养及染色体核型分析，同时将所有266例流产样本提取基因组DNA后进行高通量测序。检测均获患者及家属知情同意并签署知情同意书。

二、方法

1.绒毛细胞的培养及染色体核型分析：在严格无菌的条件下进行宫腔镜清宫术，采集胚胎绒毛标本，按照本中心建立的常规方法进行细胞培养、收获、制片、G显带，核型分析。

2.高通量测序：基因组DNA提取使用德国QIAGEN公司生产的基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行。DNA浓度控制在 50～250 ng/μl，-20℃保存。采用高通量测序文库构建试剂盒(北京贝瑞和康)完成CNV文库构建，操作严格按照试剂操作说明书进行。主要步骤包括：DNA末端修复，通用测序引物及样本识别标签(Barcodes)连接，文库构建产物纯化。构建完成 的文库采用美国KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒对文库进行准确定量。构建成功的文库根据每个样本文库的浓度进行混合(Pooling)，将混合的文库在本实验室建立的NestSeq CN500高通量测序仪平台上进行大规模测序，最小精度在100 Kb，测序深度1 X。测序结果经信息分析，将每个测序 Reads匹配到其所在的染色体上。随后做相应标准化Z值分析，通过Z值进行染色体异常判定。通过检索 DECIPHER、OMIM、ClinVar、DGV等数据库进行CNV临床意义的确定。

结 果

一、染色体核型分析结果

200例绒毛细胞获得培养成功，66例由于是稽留流产或者孕周偏大培养失败。共检测出染色体核型异常79例，其中单体17例、三体61例、双重三体1例(表1)。

表1 染色体核型分析结果

二、CNVs分析结果

266例基因组DNA标本中，4例由于DNA降解而检测失败，其余标本均检测成功。共检测出CNVs改变155例，其中致病性CNVs改变119例，包括非整倍体112例，其中单体26例、三体83例、双重三体3例(表2)；致病性缺失或者重复7例(表3)。此外检出致病性未知CNVs 2例(表3)、多态性改变CNVs 34例。

表2 CNVs分析非整倍体检测结果

表3 致病性CNVs与致病性未知CNVs分析

注：*为致病性未知CNVs

讨 论

染色体异常包括数目和结构异常，其中数目异常包含整倍体改变和非整倍体改变，染色体非整倍体中三体较为常见；结构异常包括缺失、重复、倒位、易位、插入、环状染色体和等壁染色体等。这些变异均会产生相应的遗传学效应，可能会导致变异个体表型发生严重改变，甚至死亡[6]。

常规G显带核型正常的细胞中也存在亚显微结构变异，包括染色体的微缺失、微重复等各种类型的CNVs[7]。基因组中约有 4.8%～9.5%变异属于CNVs，其中99%以上的 CNVs 是良性的，但剩余的 1%常导致严重的染色体疾病[8]。CNVs可能通过干扰基因表达影响妊娠，最终导致胎儿死亡和流产。CNVs 的可能致病机制包括CNVs的剂量效应及位置效应[9-10]、造成某些隐性致病基因的暴露[11-12]、产生新的融合基因或者打断某个与疾病相关的基因[13]。

本文研究了266例流产样本的拷贝数变异，无论核型分析还是高通量测序分析结果，流产物的拷贝数变异均以非整倍体改变为主。核型分析异常检出率为39.5%，其中，21号染色单体1例、X染色体单体16例、三体61例、双重三体1例；三体中21-三体最常见，其次为16-三体、22-三体、14-三体、15-三体等。高通量测序分析异常检出率为45.4%,其中单体26例[21.8%；(45,XN,-21)和(45,XN,-22)各1例，(45,X0)24例]；三体83例(69.7%)，三体分布情况与核型分析一致；双重三体3例(2.5%)；致病性缺失或者重复7例(5.9%)。

本文研究对象中，262例样本的拷贝数变异检测成功，除发现非整倍体改变112种外，发现CNVs 43种，检出率为16.4%。其中致病性CNVs 7例(16.3%)、致病性未知CNVs 2例(4.7%)、多态性改变CNVs 34例(79.1%)。可见，对流产物进行拷贝数变异分析可提高异常检出率，更好地发现流产的遗传学病因。

用原位荧光杂交技术进行流产物分析意义不大，检出率低[14]，而细胞培养和核型分析，培养成功率较低[3-5]。虽然流产绒毛细胞培养和核型分析成功率较低，但目前染色体核型分析仍是临床最基本的遗传学检查。高通量测序技术可覆盖全基因组进行拷贝出变异分析，除了可以发现非整倍体改变外，还可发现致病性及可能致病性CNVs，可明显提高异常检出率。临床上，可采用染色体核型分析与高通量测序技术相结，以全面地发现染色体异常改变，从而查明流产的遗传学病因，减轻患者的心理负担，为再次妊娠提供临床建议和遗传咨询。