门静脉血Angiopoietin-2 mRNA定量检测与结直肠癌异时性肝转移及预后的关系

刘少平， 胡亚华， 张 海， 何仁胜， 张惠芳

鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院)消化内科，湖北 黄石 435000

血行播散是结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的主要转移途径之一，肝脏是其血行转移的重要靶器官；癌细胞主要通过门静脉系统回流至肝脏，然后再进入全身扩散。30%～50%的CRC患者在根治术后出现肝转移，称为异时性肝转移,其已经成为CRC主要的死亡原因之一[1]。因此，CRC异时性肝转移的预测和早期诊断有重要临床意义。血管生成素-2(angiopoietin-2, Ang-2) 是肿瘤侵袭、转移的重要特征性分子， 其通过促进肿瘤新生血管形成和肿瘤淋巴管生成作用，促进肿瘤生长发展、浸润转移。近年研究[1-2]发现,Ang-2还可通过激活肿瘤细胞中MMP-2及α5β1整合素 /整合素相关激酶/ Akt，GSK-3β/Snail/ E-cad信号通路直接促进肿瘤细胞的迁徙和侵袭，这在肿瘤转移的起始阶段就发挥作用；Ang-2高表达也减少肿瘤细胞的凋亡和导致Vimentin、E-cadherin、Bcl-2、Bax、Cyclin等肿瘤形成相关蛋白表达量的变化[3]。近年研究[4-9]显示，外周血Ang-2水平与多种肿瘤的侵袭转移及预后密切相关。本研究定量检测CRC患者术中门静脉血Ang-2 mRNA的表达量，并与术前外周血中Ang-2 mRNA的表达量进行比较，探讨其与CRC异时性肝转移及预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料选择黄石市中心医院2013年1月至2014年8月经病理组织学确诊并行根治性手术治疗的原发性CRC患者89例，为CRC组，所有患者术前未行放化疗及其他抗肿瘤治疗，无远处转移病灶，无其他系统恶性疾病，男46例，女43例，年龄(57.9±12.1)岁。结肠癌58例，直肠癌31例，高、中分化者63例，低、未分化者26例，侵及T1+T2者32例，侵及T3+T4者57例，淋巴结转移者57例，无淋巴结转移者32例。黏液腺癌、印戒细胞癌纳入低分化腺癌中。所有患者术后治疗按2010版卫生部结直肠癌诊疗规范进行[10]。

1.2术后随访所有患者术后随访3年，方法为门诊复诊和电话随访，每3～6个月随访1次；无随访丢失病例；术后定期复查电子结肠镜、肝脏MRI等检查；术后随访3年中诊断CRC异时性肝转移患者15例，CRC复发患者26例，未复发转移患者63例；记录术后生存时间，术后生存期<3年者24例，≥3年者65例。

1.3标本的处理和RNA的抽提抽取CRC患者手术前1 d清晨空腹肘静脉血5 ml，手术治疗中经胃网膜或肠系膜下静脉插管10～15 cm至门静脉，抽取血液5 ml，均肝素抗凝，用淋巴细胞分层液(Amersham Biosciences公司的Ficoll-Paque PLUS)分离外周血单个核细胞，加入Trizol 1 ml (Invitrogen公司)后，用经典的方法抽提总RNA。

1.4逆转录合成cDNA用RNA电泳证实RNA未降解，测定所抽提RNA浓度。Oligo dT18(10 pmol)1 μl加入RNA 2 μg，混匀后置65 ℃水浴5 min；迅速取出转置冰上，顺序加入5×缓冲液5.0 μl、10 mmol/L dNTPs 2.5 μl、200 U/ μl逆转酶(MMLV)1.0 μl、400 U/μl RNA酶抑制剂0.5 μl，最后加DEPC水至总体积25 μl。反应条件为：37 ℃ l h，95 ℃ 5 min。逆转录产物置于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.5Ang-2mRNA荧光定量RT-PCR检测以管家基因GAPDH为内参照。应用Universal PCR Mater Mix试剂盒(ABI 公司产品)在ABI Prism 7300型实时荧光定量PCR仪上检测，以cDNA为模板扩增Ang-2 mRNA和GAPDH基因。用ABI 公司的引物设计软件Primer Express 设计引物。Ang-2上游引物为5′-CAGAGGGCTGCAAGTGCTGGAGAACA-3′，下游引物5′-GAGGGAGTGTTCCAAGAGCTGAAGT-3′；GAPDH上游引物为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反应条件为：95 ℃变性10 min，95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，共40个循环。实时荧光定量PCR仪采集hTERT mRNA及内参照GAPDH扩增各循环荧光信号，以SDS 1.4软件分析其△△Ct值及相对表达量(relative quantity, RQ)，RQ= 2-△△Ct。以GAPDH为内对照，计算Ang-2 mRNA的表达量。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计数资料比较用χ2检验，两样本比较用t检验，多样本比较采用单因素方差分析，多因素分析采用Cox回归模型。Log-Rank法比较生存率的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1CRC患者的Ang-2mRNA表达水平术后异时性肝转移组术前外周血术及中门静脉血Ang-2 mRNA表达量均明显高于术后无异时性肝转移组 (t=3.390，5.352,P均<0.01)；术后异时性肝转移组术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量显著高于其术前外周血中Ang-2 mRNA表达量(t=2.418，P<0.05)；术后无异时性肝转移组术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量与其术前外周血中Ang-2 mRNA表达量比较，无明显升高(t=1.311，P>0.05)(见表1)。

注：与术后异时性肝转移组比较，aP<0.01；与术前外周血比较，bP<0.01，cP>0.05。

2.2CRC患者术中门静脉血Ang-2mRNA表达量与其临床病理特征的关系CRC患者术中门静脉血Ang-2 mRNA的表达在肿瘤分化程度、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、是否有淋巴结转移、是否有术后复发、术后生存期长短中差异均有统计学意义(P均<0.05)，在不同肿瘤部位差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

2.3CRC患者异时性肝转移风险的单因素分析以CRC患者术中门静脉血和术前外周血Ang-2 mRNA相对表达量的均值5.85和4.56为界值，将其分为Ang-2 mRNA的高表达组和低表达组。单因素分析显示，肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、术前外周血Ang-2 mRNA表达、术中门静脉血Ang-2 mRNA表达均与异时性肝转移相关(P均<0.05)(见表3)。

注：结直肠多发肿瘤病灶时，直径取各病灶最大径之和。

表3 89例CRC患者异时性肝转移风险的单因素分析Tab 3 Univariate analysis of the risk of heterochronous liver metastasis in 89 patients with CRC

续表3

2.4CRC患者异时性肝转移的多因素分析Cox多因素回归分析显示，肿瘤浸润深度、术前外周血Ang-2 mRNA表达量、淋巴结转移、术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量均与异时性肝转移相关，是其独立危险因素。且术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量的危险度高于术前外周血Ang-2 mRNA表达量(见表4)。

表4 CRC患者异时性肝转移的Cox多因素回归分析Tab 4 Cox multivariate regression analysis of heterotopic liver metastasis in CRC patients

2.5术中门静脉血Ang-2mRNA表达量与CRC患者术后生存期的关系以CRC患者门静脉血Ang-2 mRNA表达量的均值5.85为界值，将89例患者分为高表达组(32例)和低表达组(57例)。高表达组术后1年、2年、3年的生存率分别为93.7%、71.9%、53.1%，低表达组术后1年、2年、3年的生存率分别为96.4%、91.2%、84.2%；两组术后1年生存率比较，差异无统计学意义(χ2=0.359，P>0.05)；两组术后2年和3年的生存率分别比较，差异均有统计学意义(χ2=5.467，P<0.05；χ2=10.056，P<0.01，见图1)。

图1 Ang-2 mRNA高表达组与低表达组CRC患者术后生存曲线比较Fig 1 Comparison of postoperative survival curves between high and low Ang-2 mRNA expression groups

3 讨论

目前对CRC患者异时性肝转移的早期诊断尚缺乏明确的生物化学、免疫学指标[1]，寻找敏感性和特异性均较高的CRC肝转移的预测诊断指标具有重要的临床价值。近期研究[1]发现，血清中一些特殊的生长因子水平的升高可成为CRC肝转移的预测指标。

与肿瘤组织和细胞中Ang-2表达一样，外周血Ang-2水平升高也与多种肿瘤的侵袭、转移密切相关。WANG等[5]采用ELSIA方法检测发现结直肠癌患者血清Ang-2显著高于正常对照组，且与TNM分期、淋巴结侵犯、远处转移均密切相关。BARRON等[6]研究发现，乳腺癌患者外周血中Ang-2水平明显升高，并促进癌细胞的生长与转移。HACKER等[7]应用ELISA方法检测进展期胃癌患者血浆中Ang-2水平，发现其显著升高，且与肝转移密切相关。GÜVELI等[8]研究显示，鼻咽和喉癌患者血清Ang-2水平显著升高，促进肿瘤发展。COELHO等[9]研究证实血清Ang-2水平升高与非小细胞性肺癌的发生密切相关。我们的研究[4]也发现即使在早期胃癌，血清Angiopoietin-2 水平升高参与促进了淋巴结的转移。

本研究结果显示，CRC异时性肝转移患者术中门静脉血与术前外周血的Ang-2 mRNA表达量分别高于无异时性肝转移患者。这提示术中门静脉血与术前外周血中Ang-2 mRNA高表达均与CRC异时性肝转移相关。异时性肝转移患者术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量明显高于其术前外周血Ang-2 mRNA表达量，而无异时性肝转移患者两者比较，差异无统计学意义。这表明术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量升高与CRC异时性肝转移的关系，较术前外周血Ang-2 mRNA表达量更密切；术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量越高，CRC异时性肝转移的风险也越高，术中门静脉血Ang-2 mRNA可能较术前外周血Ang-2 mRNA更敏感地反映CRC患者异时性肝转移的风险程度。本研究结果还显示，CRC患者术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量与肿瘤分化程度、肿瘤大小、浸润深度及有无淋巴结转移均呈正相关，这表明门静脉血Ang-2 mRNA表达量越高，肿瘤恶性程度越高，体积也越大，更易出现侵袭、转移，这与WANG等[5]以血清Ang-2为检测对象的研究结果相似。CRC异时性肝转移风险的单因素和多因素分析均显示，术前外周血与术中门脉血Ang-2 mRNA表达量均是CRC患者异时性肝转移的独立危险因素；术中门静脉血Ang-2 mRNA的危险度明显高于术前外周血Ang-2 mRNA，这表明前者比后者能更准确、敏感地预测术后CRC异时性肝转移。

近年研究显示，肿瘤组织中和外周血中Ang-2表达量变化与预后密切相关。KIM等[11]和HONG等[12]均应用免疫组化方法研究发现CRC患者肿瘤组织中Ang-2表达量明显升高，是预后的独立评价指标。CAADAS等[13]研究显示，血清Ang-2含量是小细胞性肺癌不良预后的评价指标。HACKER等[7]采用Cox回归模型多因素分析显示，血浆Ang-2水平是进展期胃癌预后评价的一种独立新型指标。COELHO等[9]研究发现，血清Ang-2是非小细胞性肺癌预后的独立评价指标，而血清VEGF不是。本研究显示，术后生存期<3年和术后复发的CRC患者术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量分别显著高于术后生存期≥3年和无术后复发的患者；同时，术中门静脉血Ang-2 mRNA高表达患者与低表达患者比较，其术后2、3年生存率明显降低，术后生存期更短，这表明术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量与CRC术后预后密切相关，可成为其评价指标。

综上，术中门静脉血Ang-2 mRNA表达量与CRC患者的重要临床病理特征及其异时性肝转移和预后密切相关，对CRC异时性肝转移的预测价值比外周血Ang-2 mRNA更高，可成为CRC术后预后的评价指标。