弥漫性大B细胞淋巴瘤中MYD88基因突变及其临床病理相关性分析

于宝华，薛 田，张 岩，蒋翔男，朱晓丽，李小秋

复旦大学附属肿瘤医院病理科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymohoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常见、高度恶性的一种类型。近年来虽然DLBCL的治疗取得了明显改善，但部分患者仍有较高的复发和死亡风险。因此，深入探讨其发生机制、寻找新的分子靶点成为亟待解决的问题。近年来研究发现，MYD88基因在DLBCL中有一定的突变率。MYD88基因编码蛋白为衔接蛋白，可通过Toll-like受体活化核转录因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）通路从而促进肿瘤细胞生存［1］。MYD88最常见的突变形式是位于Toll-like受体结构域L265P位点的体细胞突变。该基因在免疫隔离部位DLBCL中的突变率较高，如中枢神经系统（central nervous system，CNS）、睾丸等［2］，但不同文献报道的突变率从0%～94%不等；该突变与DLBCL临床病理特征相关性的报道也较少［3］，且在中文文献中罕见相关报道。本研究拟通过对121例发生在不同部位DLBCL中的MYD88基因突变进行探讨，并分析其临床病理相关性，旨在更好地了解MYD88 L265P突变在DLBCL中的意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2017年9月—2018年6月诊断的DLBCL患者121例，所有病例均有足够量的高质量组织标本可供进一步检测。所有患者均由2名经验丰富的淋巴造血组织专科病理医师复核、确诊。通过查阅电子病例档案及电话随访获得临床资料。

1.2 免疫组织化学检测

所有标本均经3.7%中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，3～4 μm连续切片，H-E染色。采用全自动免疫组织化学仪BenchMark XT（美国Roche公司）染色。所用一抗包括CD20、CD3、CD5、Bcl-2及Ki-67（美国Roche Ventana公司），CD10、Bcl-6及MUM1抗体（丹麦Dako公司），以及MYC抗体（英国Abcam公司）。参考试剂盒说明书和全自动免疫组织化学仪标准流程操作。根据Hans分型法将DLBCL分为生发中心样（germinal center B-cell-like，GCB）型和non-GCB型两组［4］。同时满足≥40%肿瘤细胞表达MYC蛋白及≥50%肿瘤细胞表达Bcl-2蛋白者视作双表达［5］。

1.3 MYD88基因突变检测

经常规固定、脱水、石蜡包埋的肿瘤组织样本制备成4～6 μm厚的切片，经二甲苯脱蜡、梯度浓度乙醇去除二甲苯和流水水化。核酸提取按照DNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）说明书进行。提纯后的核酸模板加入PCR混合液，采用PCR扩增MYD88基因。针对L265P位点突变的PCR引物序列为：上游引物5’-GGGG-ATGGCTGTTGTTAA-3’，下游引物5’-GCAGGGGTTGGT-GTAGTC-3’。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR纯化试剂盒（QIA quick PCR purification kit，德国Qiagen公司）纯化后，在ABI3730XL测序仪（美国ABI公司）上进行测序验证。具体操作参考仪器及配套试剂盒说明书。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。相应的相关性分析采用χ2检验、Pearson检验及Spearman检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MYD88突变及其与临床参数的相关性

121例DLBCL患者中，38例检测到MYD88 L265P位点突变，突变率为31.4%（图1）。MYD88突变患者中，男性50例，女性71例，男女比例为1.0∶1.4。年龄17～85岁，平均58.1岁（中位年龄60岁）。年龄≥60岁组MYD88突变率为40.3%（25/62），显著高于＜60岁患者组（13/59，22.0%）（P=0.030）。男性患者中该基因突变率（17/50，34.0%）与女性患者中的突变率（21/71，29.6%）差异无统计学意义（P=0.609，表1）。

本组患者中20例发生在结内，98例发生在结外，其余3例原发灶不明。MYD88突变主要发生在结外部位，包括乳腺12例（12/13，92.3%）、男性生殖系统10例（10/11，90.9%；其中睾丸9/10，前列腺1/1）、女性生殖系统5例（5/6，83.3%；其中卵巢2/2、宫颈3/3、子宫体0/1）、CNS 4例（4/6，66.7%）、淋巴结2例（2/20，10%）、皮肤1例（1/2，50%）、口咽环1例（8.3%，其中口咽部1/3、扁桃体0/9）、腹膜后1例（1/1，100%）、鼻腔1例（1/2，50%）和原发不明1例（1/3，33.3%）。其余部位未检测到MYD88突变，包括胃肠道（0/25）、脾（0/3）、纵隔及肺（0/6）、鼻咽（0/2）、肾上腺（0/1）、外阴及阴道（0/2）、眼眶（0/2）和骨及软组织（0/4）。统计分析结果显示，MYD88基因突变与患者的发病部位显著相关，结外者（35/98，35.7%）显著高于结内者（2/20，10%）（P=0.024，表1）。

2.2 MYD88突变与病理参数的相关性

本组患者形态均为DLBCL，非特指性（图2）。118例有分型信息的患者中，55例为GCB型，63例为non-GCB型。Non-GCB型DLBCL患者中，MYD88突变率为39.7%（25/63），显著高于GCB型（10/55，18.2%）（P=0.010）。发生于结外的DLBCL患者中，MYD88基因在non-GCB型中的突变率为47.1%（24/51），显著高于GCB型（8/44，18.2%）（P=0.003）；而结内DLBCL患者中，MYD88基因突变与免疫分型没有显著相关性（P=0.776，表1）。

Bcl-2蛋白表达阳性组中MYD88突变率为39.0%（30/77），Bcl-2阴性组中为12.5%（5/40），差异有统计学意义（P=0.003）。Bcl-2/MYC蛋白双表达组中MYD88突变率（19/46，41.3%）显著高于非双表达组（16/70，22.9%）（P=0.034，表1）。Ki-67增殖活性与MYD88基因突变显著相关，高增殖活性组（Ki-67指数≥80%）中MYD88突变率高达38.8%（33/85），而低增殖活性组中仅为6.3%（2/32）（P＜0.001）。但该基因突变与MYC蛋白及CD5表达均无相关性（P=0.581，P=0.759，表1）。

图 1 MYD88 L265P位点突变Fig.1 MYD88 L265P mutation in DLBCLA CTG (leucine) codon was changed to a CCG (proline) codon (arrow)

表 1 121例DLBCL患者中MYD88 L265P突变与临床病理参数的相关性Tab. 1 The correlation between MYD88 L265P mutation and clinicopathological parameters in 121 cases of DLBCL[n (%)]

图 2 1例有MYD88 L265P突变的宫颈原发DLBCL，同时伴有MYC/Bcl2双表达Fig. 2 A representative case of primary cervical DLBCL harboring MYD88 L265P mutation and MYC/Bcl2 doubleexpressionA: Large atypical lymphoid cells were diusely infiltrated (H-E, ×400).B and C: Immunohistochemical stainings for both MYC (B) and Bcl2 protein (C) were positive (EnVision, ×400)

3 讨论

DLBCL是一组临床和生物学上均具有异质性的肿瘤。虽然相当一部分患者可获得较好的疗效，但仍有部分患者发生耐药或复发。对于预后较差的患者，深入探讨其分子生物学机制具有重要的临床意义。近来有学者根据DLBCL基因型、表观遗传学及临床特征的不同将其分为4型，其中一型（MCD型）以MYD88和CD79B基因突变为主要特征，提示MYD88基因突变在DLBCL发生、发展、治疗及预后评估中可能具有重要作用［6］。既往文献报道，MYD88基因在DLBCL中的突变率有较大差异（0%～90%），该差异可能与患者选择、所用检测技术不同以及是否仅检测L265P突变还是检测外显子3～5所有突变有关［7-8］。Lee等［3］通过Meta分析表明，2 736例DLBCL患者中，该基因突变率约29.0%。

DLBCL中MYD88基因突变与发病部位显著相关，尤其好发于免疫隔离部位如CNS及睾丸等，另外乳腺、女性生殖系统及原发皮肤者也有较高的突变率［3，9-10］。本研究结果与既往文献报道大致相似，女性生殖系统、睾丸、乳腺及CNS均显示较高的突变率（66.7%～92.3%）。Zheng等［8］认为，CNS中高突变率可能与肿瘤细胞的微环境相关。具有MYD88突变的DLBCL患者可能在其外周血单核细胞中也有低频的相同突变，提示MYD88突变阳性的癌前细胞可能起源于CNS之外，并且在经过适应CNS环境的额外基因异常打击之后发展成CNS淋巴瘤［8］。原发淋巴结内DLBCL中该基因突变率非常低，文献报道为0%～38%（中位值为10%），本研究结果（10%）在该范围内［3，11］。大部分文献报道胃肠道DLBCL中MYD88基因罕见或无突变［7，12］，但个别文献也曾报道有较高的突变率（11%）［2］；本组数据中，25例胃肠道DLBCL中均未检测到突变，与大部分文献报道相似。另外，纵隔、脾脏等部位突变情况均未见文献报道，本组患者中均未检出突变；但由于病例数较少，有待扩大样本量进一步验证。MYD88基因突变在不同部位DLBCL中的差异提示这些部位的DLBCL可能具有不同的发病机制，至少一定程度上与组织微环境相关［13］。

早在2011年，Ngo等［1］首次报道MYD88 L265P突变在活化B细胞样（activated B-cell -like，ABC）型DLBCL中高达29%，而在其他亚型DLBCL中非常罕见。该突变可导致IRAK4激酶活化、IRAK1磷酸化、NF-κB通路及JAK/STAT3通路活化，从而促进肿瘤细胞生存，提示MYD88信号通路可能是ABC型DLBCL发生、发展过程中不可或缺的重要因素［1］。随后多数研究证实，MYD88突变与DLBCL分子分型呈显著相关，但阳性率报道不一，在ABC型DLBCL中突变率为21.6%～31.2%，而在GCB型中突变率主要集中在6.0%～9.7%范围内［2］。本研究结果显示，non-GCB型DLBCL中MYD88突变高于GCB亚型，与大部分文献报道相似，尤其是在结外DLBCL中；GCB型DLBCL中MYD88突变率为18.2%，高于既往多数文献报道，但与Rovira等［7］的结果（18%）相似。

MYD88与DLBCL中MYC、Bcl-2蛋白表达关系的相关文献报道极少。Rovira等［7］报道MYD88突变型DLBCL中MYC/Bcl-2双表达率显著低于野生型，而Dubois等［14］认为ABC型DLBCL中MYC/Bcl-2蛋白双表达及MYC单一基因表达与MYD88突变均不相关。本研究结果显示，MYD88突变型中MYC/Bcl-2双表达率（54.3%）显著高于野生型（33.3%）。该结果虽然与上述文献报道结果不符，但与MYC/Bcl-2双表达者常见于ABC亚型且预后较差等相一致［15-16］。另外，本研究结果显示，单一Bcl-2蛋白表达也与MYD88基因突变显著相关，而单一MYC蛋白表达与该基因突变并无相关性。Dubois等［14］曾报道ABC型DLBCL中Bcl-2过表达更多见于MYD88突变者中，具有MYD88突变的GCB型DLBCL也倾向于Bcl-2过表达，与本研究结果大致相符。MYD88突变与MYC、Bcl-2表达的相关性及其内在机制值得进一步深入研究探讨。

约10%的DLBCL中有CD5蛋白表达，CD5+DLBCL具有较高的临床侵袭性和较高的CNS复发频率［17］。Takeuchi等［17］报道40例CD5+DLBCL中MYD88突变率为33%。本组CD5+患者中该突变率为30.8%，但CD5表达并未显示出与MYD88突变的相关性。由于本组患者中CD5+者较少，有待积累更多病例进一步研究证实。

关于MYD88基因突变在DLBCL中预后价值的研究报道较少且存在争议。部分研究认为该基因突变与DLBCL患者预后无相关性，包括原发乳腺及CNS的DLBCL［8，10，17-19］。但也有研究认为MYD88基因突变者预后较差，并且可以作为原发皮肤DLBCL（腿型）的独立预后因子［7，9，19］。2017版造血与淋巴组织肿瘤世界卫生组织（World Health Organization，WHO）分类中也指出原发皮肤DLBCL（腿型）中MYD88突变与预后差相关［5］。本组患者随访时间较短，需要积累更多病例并延长随访时间进一步分析MYD88突变与DLBCL患者预后的相关性。

MYD88突变型DLBCL可能对抑制NF-κB或JAK/STAT通路的靶向药物具有较高的敏感性，目前正在研究中的药物包括布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase，BTK）和PI3K抑制剂，具有MYD88突变的ABC型DLBCL患者对BTK选择性抑制剂依鲁替尼反应较好［20］。因此，MYD88突变状态可能是一项较好的DLBCL患者治疗反应的预测因素［3，7］。

综上所述，MYD88 L265P突变好发于年龄≥60岁、ABC（non-GCB）起源及特殊结外部位（包括乳腺、中枢神经系统及生殖系统等）的DLBCL，并且具有较高的增殖指数及MYC/Bcl-2蛋白双阳性率；其预后价值有待积累更多病例进一步分析。MYD88基因突变有望为揭示DLBCL发病机制、靶向治疗提供理论依据，并且可能成为靶向治疗反应的有效预测因子。