小干扰RNA下调PLK1表达对食管腺癌细胞肿瘤生物学行为的影响

杜媛鲲，赵永波，米源，陈阁，廖海江，王雷

（河北医科大学 1. 期刊社，石家庄 050017； 2. 第四医院胸心外科，石家庄 050011）

食管癌在全球所有恶性肿瘤的发病率占第8位，死亡率占第6位，其中我国是食管癌高发区，每年新发病率和死亡率均居世界第1位。食管癌的病理类型主要包括食管鳞癌和食管腺癌，虽然近年来食管鳞癌的死亡率有所下降，但食管腺癌的发病率上升了3～4倍，且患者就诊时多数为进展期，即使采取手术联合放化疗等综合治疗，仍然容易复发转移，5年生存率低于20%［1-2］。polo样激酶1 （polo-like kinase 1，PLK1） 属于广泛存在于真核生物细胞内的丝氨酸-苏氨酸激酶家族之一，作为细胞有丝分裂关键的调控因子，在启动、维持和完成有丝分裂的过程中起着重要的作用，尤其是在细胞周期的G2/M阶段发挥重要调控作用。近年来多项研究证实PLK1在前列腺癌［3］、胰腺癌［4］、胃癌［5］和肺癌［6］等多种恶性肿瘤中高表达，抑制其表达可以通过减少细胞增殖、促进凋亡等机制起到显著抗肿瘤作用。目前国内外关于PLK1的表达调控与食管腺癌发生发展关系的研究较少，所以本研究通过小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）调控PLK1在食管腺癌OE33细胞中的表达，探讨了PLK1与食管腺癌细胞生长和侵袭的影响及可能的分子机制，旨在为以PLK1为靶点的食管腺癌的基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及细胞株：人食管腺癌细胞株OE33购自英国Sigma-Aldrich公司，胎牛血清购自美国Gemini公司，RPMI 1640 培养液购自美国Corning公司，Silencer® Select PLK1 siRNA、control siRNA、TaqMan®PLK1引物和探针 （Hs00983227_m1） 以及TaqMan®GAPDH （Hs02758991_g1） 购自美国Life Technologies公司，Transwell膜嵌套、Matrigel胶购自美国BD公司，Opti-MEM培养基、Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，TaqMan®基因表达预混液购自美国Applied Biosystems公司，iScript® cDNA合成试剂盒、Tris/甘氨酸缓冲液、Tris/甘氨酸/蛋白电泳缓冲液、Mini-PROTEAN TGX预制胶购自美国Bio-Rad公司，总RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，E-cadherin、N-cadherin、PLK1、GAPDH、C-myc一抗均购自美国Abcam公司，ECL化学发光试剂盒、Pierce-BCA蛋白分析试剂盒购自美国Thermo Scientific公司，PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.1.2 主要仪器设备：Synergy-HT多功能酶标仪购自美国Bio-Tek公司，ABI Prism 7900HT型荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司，小型Trans-Blot®转印槽购自美国Bio-Rad公司，NanoDrop 8000全光谱紫外-可见光分光光度计购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染：OE33细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基在37 ℃、CO2维持在5%左右的恒温恒湿培养箱中培养，显微镜观察细胞生长情况，待细胞融合达80%左右进行传代培养。将呈对数生长期且生长状态良好的OE33细胞按3×105/孔接种于6孔板上，待细胞融合生长达到50%～60%时更换无血清培养基，设立空白对照组 （Control组） ，并按照Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂说明书进行PLK1 siRNA干扰引物的转染，每组各设3个副孔，转染时每孔PLK1 siRNA及空白对照Control siRNA的终浓度均为100 nmol/L，于转染6 h后更换新的培养基并置于培养箱中继续培养至48 h。

1.2.2 实时荧光定量PCR法检测转染前后PLK1基因的表达：

1.2.2.1 总RNA的提取 PBS洗涤转染48 h后的OE33细胞，参照总RNA提取试剂盒说明书提取每组样本总RNA，将纯化的RNA放在NanoDrop 8000全光谱紫外可见光分光光度计仪器中检测RNA浓度。

1.2.2.2 逆转录合成cDNA 参照iScript® cDNA合成试剂盒的说明书进行每组样本cDNA的反转录。总反应体系40 μL：iScript 逆转录酶2 μL，iScript反应混合液8 μL，总RNA 500 ng，其余加RNase水配齐至40 μL，置于Veriti® 96-Well Thermal Cycler仪器中，在25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min的条件下进行cDNA合成，所得cDNA在-20 ℃保存备用。

1.2.2.3 实时荧光PCR扩增 用无RNase水将合成的每组cDNA稀释10倍作为模板。按照10 μL/孔的反应体系：Taqman 基因表达预混液5 μL，TaqMan®PLK1物和探针0.5 μL或TaqMan® GAPDH引物和探针0.5 μL、样本cDNA 4.5 μL，加入到美国ABI 荧光定量PCR仪专用384孔板上 （冰上） ，瞬时离心后于ABI 7900HT PCR仪中在95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s的条件下进行PCR扩增，40个循环。将ABI7900仪器输出数据按照2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.3 蛋白印迹法检测沉默PLK1基因后相关蛋白的表达：PBS洗涤转染48 h后OE33细胞，将6孔板置于冰上，每孔分别加入含有蛋白酶抑制剂的M-PER细胞总蛋白提取试剂100 μL，收集样本的总蛋白提取液并离心取上清，此上清即为样本的细胞总蛋白。BCA法测定样本的总蛋白浓度。于小型 Trans-Blot®转印槽中加上Tris/甘氨酸/蛋白电泳液，在Mini-PROTEAN TGX预制胶中行每组样本蛋白上样，电泳工作条件200 V 50 min。用双蒸水短暂冲洗凝胶，用水和转膜缓冲液冲洗凝胶15 min后于Tris/甘氨酸缓冲液中转至PVDF膜 （冰浴） ，工作条件100 V 1 h。室温含5%脱脂奶粉的TBST液封膜1 h，根据目的蛋白不同分子量剪膜，分别加入一抗PLK1 （1∶1 000） ，一抗C-myc （工作浓度为1∶1 000） ，一抗N-cadherin（1∶500） ，一抗 GAPDH （1∶20 000） ，一抗E-cadherin（工作浓度为1∶10 000） ，置于4 ℃环境下摇床孵育过夜。第2天收集一抗后用TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL试剂均匀滴于PVDF膜上5 min，用X线感光片在暗室曝光显影、定影，使用Image软件测量目的蛋白相对表达量 （显影条带） 。

1.2.4 流式细胞术检测转染PLK1基因后细胞周期的变化：将转染48 h的OE33细胞PBS洗涤，胰酶消化贴壁细胞，收集细胞制备成单细胞悬液，冷PBS漂洗，加1 mL PBS吹打均匀重悬细胞，缓慢加入4 ℃70%冰乙醇5 mL （置振荡器上旋转搅拌） ，固定30 min以上。冷PBS漂洗3次去除乙醇，重悬细胞后加含40 μg碘化丙啶和100 μg RNaseA的PBS，避光4 ℃染色30 min。400目尼龙网过滤，采用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期进行拟合分析，检测每组样品的DNA含量，碘化丙啶激发波长为488 nm。

1.2.5 Transwell侵袭实验：将Matrigel胶放到4 ℃冰箱过夜，待其变为液态。把Matrigel基质胶的聚碳酸酯膜平铺于Transwell小室的下室上面。收集转染后的OE33细胞用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞计数，加入到Transwell小室的上室。下室加含10%血清的培养液，然后继续放到37 ℃ 5% CO2恒湿温箱内孵育，24 h后用棉棒擦去上层基质胶和未迁移的细胞，甲醇固定聚碳酸酯膜30 min，结晶紫染色10 min，流水漂洗，晾干膜，倒置显微镜高倍视野下观察穿膜细胞数，随机取4个视野并计算平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR方法检测PLK1基因沉默后PLK1基因表达量的变化

PLK1 siRNA组PLK1 mRNA表达水平为 （0.26±0.02） ，较Control组 （1.00±0.02） 显著降低，差异有统计学意义 （t = 51.16，P ＜ 0.001） 。

2.2 Western blotting检测蛋白表达

应用Image软件测量OE33细胞PLK1、E-cadherin、N-cadherin和C-myc蛋白表达。PLK1 siRNA组PLK1、N-cadherin、C-myc蛋白表达较Control组均显著减少（PLK1：0.26±0.02和1.00±0.02，P ＜ 0.001；N-cadherin：0.51±0.02和1.00±0.02，P ＜ 0.001；C-myc：0.24±0.03和1.00±0.04，P ＜ 0.001） ，差异均有统计学意义；PLK1 siRNA组E-cadherin （1.78±0.02） 蛋白表达较Control组（1.00±0.03） 显著增加 （t = -40.30，P ＜ 0.001） ，差异有统计学意义。见图1。

图1 Western blotting检测OE33细胞中PLK1、E-cadherin、N-cadherin和C-myc蛋白表达Fig.1 PLK1，E-cadherin，N-cadherin，and C-myc expression of OE33 cells determined by Western blotting

2.3 流式细胞术检测细胞周期的影响

结果显示：PLK1 siRNA组G2/M期细胞为 （14.63±1.36） %，与Control组 （7.47±0.38） %比较显著增高，差异有统计学意义 （t = -8.81，P = 0.001） ；S期细胞为（44.77±0.64） %，与Control组 （51.37±0.45） %比较降低，差异有统计学意义 （t = 14.68，P ＜ 0.001） ；G1期细胞为 （40.60±1.15） %，与Control组 （41.17±0.81） %比较 ，差异无统计学意义 （t = 0.70，P = 0.524）。见图2。

2.4 Transwell侵袭实验

与Control组穿膜细胞数 （115±3.51） 相比，PLK1 siRNA组穿膜细胞数 （76±3.51） 明显减少，差异有统计学意义 （t = -13.49，P = 0.000） ，见图3。

图2 流式细胞术检测细胞周期的变化Fig.2 Cell cycle changes determined by flow cytometry

图3 siRNA沉默PLK1基因后OE33细胞侵袭能力的变化 ×400Fig.3 Effect of siRNA PLK1 on OE33 cell invasion ability determined by the Transwell invasion assay ×400

3 讨论

PLK1在多种人类肿瘤中过表达和高度活跃，与肿瘤细胞生长与增殖所必需［7］，不但能直接作用于细胞的恶性转化，而且可以通过磷酸化G2/S表达蛋白和Topors抑制p53的活性，帮助DNA受损的细胞逃逸监测点的阻滞，以增加染色体不稳定，最终导致肿瘤的发生。此外也有研究［8］发现，PLK1与肿瘤侵袭转移以及预后密切相关，鉴于PLK1在肿瘤发生发展中起着重要作用以及PLK1抑制剂可以通过阻滞有丝分裂来诱导细胞凋亡，PLK1可以作为一个潜在的有效抗肿瘤靶点［9］。目前尚不清楚PLK1调节食管腺癌细胞生物学行为的确切机制，由于近年来针对基因采取的精准医疗显示出良好的抗肿瘤前景，因此本研究通过应用RNA干扰下调OE33细胞的PLK1基因表达，观察其抗肿瘤效果。研究结果显示，转染PLK1 siRNA 48 h后的OE33细胞内源性PLK1 mRNA和蛋白表达均显著下调，明显低于Control组，提示OE33细胞中存在高表达，特异性的PLK1 siRNA可以显著下调食管腺癌细胞内源性PLK1的表达。

细胞周期包括细胞分裂期 （M 期） 和间期2个阶段，本研究应用流式细胞术对转染PLK1 siRNA后OE33细胞的周期分布变化进行分析。结果显示，PLK1 siRNA组较Control组相比可将更多细胞阻滞于G2/M期，从而调控肿瘤细胞的增殖。这与AMANI等［10］采用PLK1靶向抑制剂BI 6727处理神经胶质瘤细胞，发现可以通过显著阻滞细胞于G2/M期，导致肿瘤细胞增殖和凋亡增加的结果一致。为进一步探讨食管腺癌细胞PLK1表达和周期变化的可能机制，本研究对细胞周期相关蛋白C-myc表达进行检测。C-myc是细胞周期的关键因子也属于原癌基因，其作为转录因子可调控细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E等表达促进胞DNA复制，诱导细胞增殖［11］。TAN等［12］研究发现，肿瘤细胞中可能存在PDK1-PLK1-Myc通路，PLK1是PDK1/Myc通路中的核心成份，PDK1通过激活PLK1后进一步激活Myc，共同维持肿瘤的生长增殖和分化。本研究发现沉默PLK1基因后C-myc蛋白表达下降，表明在食管腺癌细胞中PLK1信号通路激活后诱导细胞恶性转化的途径之一，可能是通过上调C-myc表达对细胞周期进行调控，从而促进细胞异常增殖。

上皮-间质转化指上皮细胞在特定条件下转化为间质细胞的过程，在此过程中表现为E-cadherin等上皮表型标志下调［13］，N-cadherin和Vimentin等间质表型特征分子［14］表达上调等特征，通过此转化导致肿瘤细胞侵袭与转移能力显著增强［15］。CAI等［8］研究发现，PLK1可以通过调节AKT途径促进胃癌细胞的转移和上皮间质细胞转化的能力。本研究表明，抑制PLK1表达后可导致E-Cadherin蛋白表达上调以及N-Cadherin蛋白表达下调，从而促进了上皮-间质转化过程。并且Transwell侵袭实验进一步显示，敲掉PLK1基因后可导致细胞侵袭能力明显下降，穿膜细胞数明显减少，分析其原因可能是PLK1通路通过诱导食管腺癌细胞的上皮-间质转化过程促进侵袭转移。

综上所述，本研究发现PLK1在食管腺癌细胞的生长增殖和诱导上皮-间质转化、促进侵袭转移的过程中发挥重要作用，PLK1可能成为食管腺癌分子靶向治疗的一个有吸引力的靶标。