氮添加对白羊草土壤球囊霉素含量特征的影响

吴 阳,李 强,徐红伟,乔磊磊,李袁泽,薛 萐,

(1.西北农林科技大学 资源环境学院,陕西 杨凌712100; 2.榆林学院 陕西省陕北矿区生态修复重点实验室,陕西 榆林719000; 3.中国科学院 水利部 水土保持研究所 黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室,陕西 杨凌712100; 4.西北农林科技大学 水土保持研究所,陕西 杨凌712100; 5.西北农林科技大学 林学院,陕西 杨凌712100)

从上个世纪中叶开始，由于矿物燃料燃烧，含氮化肥生产和使用及畜牧业等人类的活动[1]，大大的增加了进入陆地和水生系统的活性N的数量[2-3]。过量的N输入会改变土壤有机质的分解，影响土壤团聚体结构和土壤体积密度，从而改变土壤理化性质和自然结构[4-6]。氮是植物生长的限制性因子，氮的过多输入势必会影响植物的生长，与此同时，也会影响与其共生的AM真菌的生长[7-14]。

丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza Fungi，AMF)是土壤中重要的微生物群落之一[15]。普遍存在于陆地生态系统中，研究表明80%以上的陆生维管束植物具有丛枝菌根[16]。AMF作为桥梁，连接土壤和植物的根，在植物营养中扮演着重要的角色[17]。AMF可以通过增加宿主植物对矿物质元素的吸收和循环，从而促进植物的生长[18-19]。还可以提高植物耐受胁迫的能力，提高植物对干旱和病原体的抗性[20-21]，以及提供营养种间转移的途径，改善土壤水分，土壤结构等[16]。球囊霉素或者球囊霉素相关蛋白(glomalin-related soil protein，GRSP)，是AMF真菌分泌的一种疏水性蛋白，目前根据Wright[22]提取法可将其分为总球囊霉素(Total glomalin，T-GRSP)和易提取球囊霉素(Easily ex-tractable glomalin，EE-GRSP)。球囊霉素作为土壤有机碳，氮的重要来源[23]，被称为“超级胶水”的它，可以极大地提高、改善土壤颗粒的稳定性[24]，改善土壤有机结构和土壤特性[25]，提高土壤有机碳的固定能力[26]。土壤GRSP质量的变化还可以作为改善流域管理和保护水生生态系统的指标[27]。所以，土壤GRSP对于土地质量的改善，评价以及指示土壤碳库的变化具有重要的意义。

关于GRSP分别在农田、针叶林、沙漠、温带森林、温带草地以及热带雨林都有研究[28]。另外，不同的土地利用方式[29-31]以及施肥方式[32-33]对土壤GRSP的也具有显著的影响。N沉降作为目前非常普遍的一种环境变化[4-6,34-35]，然而目前针对氮沉降对土壤GRSP含量的影响研究相对较少，且还没有一致的结论。因此，本研究以黄土高原典型地带性植物白羊草(Bothriochloaischaemum)为研究对象，采用小车控制试验，通过氮添加模拟氮沉降对GRSP的影响，旨在揭示未来全球变化背景下，土壤生态过程的响应机制，为区域生态建设提供科学依据和数据支持。

1 材料和方法

1.1 试验地点介绍

小车模拟小区试验设在陕西省杨凌区(108°4′27.95″E，34°16′56.24″N)西北农林科技大学水土保持研究所内。日平均气温13.2℃，平均降水量674.3 mm，日照1 993.7 h，无霜期225 d，属温带大陆性季风气候。

1.2 试验设计和样品采集

试验采用自制移动变坡式土槽，尺寸规格为：长×宽×高=2.0 m×1.0 m×0.5 m，试验用白羊草种子采自陕西省安塞县(109°14′E，36°92′N)，供试土壤采自陕西省安塞县表层黄绵土(0—20 cm)，土壤容重控制在1.2 g/m3左右，分四层装土，每层10 cm，填土总高度40 cm，试验坡度为15°。按照密度10 cm×10 cm，深度0.5 cm种植白羊草，模拟白羊草纯群落。试验期间，除拔掉杂草外，不做任何人工处理。根据全球N沉降水平和发展趋势，试验设4个水平，5个处理，每个处理3个重复，裸地(LD)既无植被也不进行氮添加处理，对照CK(0 g/m2)、N1(2.5 g/m2)、N2(5 g/m2)和N3(10 g/m2)有植被且按照试验设计浓度进行氮添加处理，4个水平氮添加参考目前全球N沉降浓度设计[36]，氮肥为尿素(CO(NH2)2)。

本试验设计为两年、2013年份氮添加在2013年8月份一次性施入，2014年份氮添加在白羊草生长季(5月—8月)进行，每月添加一次，添加量为全年施氮水平的四分之一。施氮方法为：将尿素充分溶解在1 L水中，于雨前均匀喷撒到试验小车内，裸地(LD)及对照组(CK)只喷洒相同体积的水。将小车置于室外培育，不做任何处理。取样于2014年9月底进行，方法为：在小车内随机选取6个10 cm×10 cm×10 cm 的样方，剔除根系，土壤混匀后过1 mm筛并风干备用，用于土壤基本指标和GRSP含量的测定。

土壤基本理化性质采用常规方法[37]测定：土壤有机碳(Soil organic carbon，SOC)用重铬酸钾氧化—外加热法；土壤全氮(Total N)采用凯氏定氮法；土壤全磷(Total P)采用硫酸—高氯酸消煮，钼锑抗比色法测定；土壤硝态氮用水浸提，采用紫外分光光度法测定；土壤铵态氮用水浸提，采用连续流动分析仪测定；pH值用pH计测定(水∶土=2.5∶1)；土壤速效磷(Available P)采用碳酸氢钠提取钼锑抗比色法测定。

GRSP含量的测定分为两个部分：浸提是按照Wright和Upadahyaya[24]提出的方法。(1) 易提取球囊霉素相关土壤蛋白(EE-GRSP)浸提：称取供试土样1.00 g，加入8 ml 20 mmol/L， pH值为7.0的柠檬酸钠溶液，121℃条件下浸提30 min，立即将浸提液以10 000 rpm离心5 min，然后将上清液倒入10 ml离心管中，保存于4℃冰箱中备用。(2) 总球囊霉素相关土壤蛋白(T-GRSP)浸提：称取供试土样1.00 g，加入8 ml 50 mmol/L，pH值为8.0的柠檬酸钠溶液，121℃条件下浸提60 min，随即将浸提液以10 000 rpm离心5 min后，将上清液倒入50 ml离心管中，补充等体积的浸提液，继续浸提，浸提6次。合并所有浸提液，保存于4℃下待测。浓度测定采用考马斯亮蓝测定蛋白质的方法：取浸提液1 ml于10 ml离心管，加入5 ml考马斯亮蓝,显色2 min后于595 nm下比色。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2007进行整理分析，用SPSS 20.0进行统计分析，采用Canoco 5.0进行冗余分析(RDA)。

2 结果与分析

2.1 氮添加对土壤基本理化性质的影响

在CK和LD相比，土壤有机碳、全氮以及全磷含量均有所升高，但无显著性差异。硝态氮、铵态氮和速效磷含量降低，但硝态氮未达到显著水平。和CK相比，不同浓度氮添加后土壤全氮、铵态氮、硝态氮和全磷含量均呈增加趋势，其中铵态氮有显著差异，硝态氮无显著差异，全氮和全磷在N3达到显著水平。土壤有机碳先升高后降低，但均未达到显著水平。速效磷和pH值随着N浓度升高逐渐降低，其中速效磷在N1达到显著水平，pH值则未有显著差异(表1)。

表1 土壤基本理化性质

注：不同小写字母表示不同处理之下同一指标有显著差异(p<0.05)。

2.2 N添加对土壤GRSP含量的影响

CK和LD相比，T-GRSP，EE-GRSP含量均降低，但都未达到显著水平。随着氮添加浓度增加，土壤中T-GRSP含量总体上呈现先增加后减少趋势，在N1时浓度最高，但差异不显著(p<0.05)(图1所示)。其中EE-GRSP含量与CK相比，在N3时降低达到显著性水平，其余处理均无显著性差异(p<0.05)。

N沉降作为21世纪新近出现的环境问题，所引起的一系列的生态环境变化，已经日益引起人们的关注[38]。但是，N沉降对土壤GRSP含量的影响在国内外研究较少[35]。Treseder等在对27个生态系统的球囊霉素含量的文献调查显示：N，P的添加对土壤中球囊霉素含量的变化没有影响[28]。Wuest等通过对种植冬小麦的土壤进行不同浓度的N(0，45，90 kg/hm2)添加，也得出了相同的结论，即N添加对土壤GRSP含量的变化并无显著的差异[34]。以上研究均和本试验结果类似，N添加对土壤GRSP的含量变化并无显著性影响。GRSP是AM真菌分泌的一种含铁的特殊蛋白物质[22]。张骄阳等研究了在相同处理下土壤微生物群落结构的变化规律，结果显示真菌PLFA含量变化先增加后降低，且在N1时达到最大[39]，吕凤莲在对油松根际土微生物群落研究中，设置了0，2.8，5.6，11.2，22.4 g N/(m2·a)共5种N添加浓度后得出：AMF的丰度随着N添加浓度先升高然后在降低[14]，走向均和本试验GRSP类似。所以出现GPRS的含量没有显著变化可能的原因是：最初的N添加，并没有改变AM真菌的丰度[35]。然而在本研究中，EE-GRSP在N3时显著性降低，所以当N添加达到一定浓度后，会抑制AMF的生长，从而降低土壤GRSP的浓度。但是GRSP和AMF之间的作用机制，还有待进一步研究[32]。

2.3 土壤GRSP含量的冗余分析

对土壤T-GRSP，EE-GRSP和土壤全氮、全磷、有机碳、速效磷、硝态氮、铵态氮、pH值，C/N以及地上和地下生物量10个环境因子进行冗余分析(RDA)，由于考虑到生物量因素，我们此处并未对LD进行分析，表明：RDA1和RDA2分别解释了97.00%和2.64%的变化，10种环境因子共同解释了99.64%的GRSP含量变化。SOC，C/N与EE-GRSP呈显著正相关，是影响其的主要因素，地上、地下生物量、SOC，C/N和铵态氮与T-GRSP呈显著正相关，全磷与T-GRSP和EE-GRSP皆呈显著负相关(图2)。

以上结果表明土壤C/N，SOC对土壤GRSP含量影响显著，这和前人研究结果基本吻合。1998年，Wright和Upadhyaya发现了37种不同土壤的GRSP和SOC含量变化呈现显著相关性[40]。Riling[41]、Jing Zhang[26，35]和杜介方[32]等也发现了二者呈现显著的相关性，其结果都和本试验相似。Riling等发现在AMF的菌丝生长时，SOC是影响GRSP生成的主要因素[42]。Jing Zhang等在对中国南部的人工林，次生林和原始森林土壤中GRSP和SOC的13C进行NMR分析结果得出：GRSP中烷基C和芳香族C的总和与O-烷基C和羧基C的总和之比的值明显高于SOC中的值，说明：GRSP含有丰富的烷基C和芳香族C，这些特殊的结构可以调节SOC的固定[26]。GRSP的平均寿命大概为6～42 a[42]，其作为土壤C库的重要组成部分，在一定程度上可以反映土壤C库的变化情况[42]。所以研究土壤GRSP和SOC之间的含量变化对土壤质量以及管理具有重要的意义。

注：不同小写字母表示不同处理之下同一指标有显著差异(P<0.05)。

图1不同的N添加对土壤T-GRSP和EE-GRSP含量的影响

图2 GRSP含量和环境因子的冗余分析

3 结 论

在经过不同浓度N1(2.5 g/m2)、N2(5 g/m2)和N3(10 g/m2)添加后，以裸地(LD)和不进行氮添加处理CK(0 g/m2)为对照，土壤中T-GRSP含量呈现先增加后降低的趋势，但变化未达到显著水平，而土壤EE-GRSP的含量变化在N3时显著降低(p<0.05)。冗余分析表明：SOC，C/N是影响土壤GRSP的主要因素。由于本实验室为人工控制下进行的培养试验，且试验周期较短，因此很难从机理上揭示氮添加对GRSP的作用机制，因此在下一阶段需要加强此方面的工作，特别是氮添加后AMF和GRSP之间的作用关系研究。