黑木耳多糖提取方法比较研究*

马思琦 朱佳雪 周莉华 王音然 宋琴玲 陈瑞鹏

（山东协和学院 山东济南 250109）

引言

多糖广泛存在于高等植物、真菌、藻类中，主要由醛糖和酮糖通过糖苷键连接起来。黑木耳（Auricularia heimuer F.Wu，B.K.Cui＆Y.C.Dai）又名木耳、耳子、云耳等，属药食兼用真菌，是我国珍贵的食用和药用的真菌，黑木耳富含多糖、纤维素等大量活性物质，营养丰富，其中多糖是黑木耳中最有效的活性成分之一，[1]黑木耳多糖具有降血糖、降血脂、抗血栓形成、提高机体免疫功能、抗衰老、改善心肌缺氧、抗溃疡、抗放射以及对组织损伤具有保护作用，同时还能促进核酸、蛋白质的生物合成，并防治多种老年疾病，具有重要的研究价值。近年来，随着糖科学和糖技术的发展，黑木耳多糖已经日益被人们所重视。确定黑木耳多糖的最佳提取工艺，便能提高黑木耳多糖的提取效率，降低黑木耳多糖的开发成本及损耗，由此获得杂质更少纯度更高的黑木耳多糖，为人类的健康和安全提供更为有利的帮助。[2]

本研究拟使用水提法，纤维素酶法、微波提取法、超声波辅助提取法提取黑木耳多糖，通过正交实验选择最佳的黑木耳多糖提取工艺，为黑木耳的深加工提供参考。

一、实验条件与方法

1．实验材料

（1）原料：黑木耳产自黑龙江省大兴安岭。

主要试剂：浓硫酸、苯酚、石油醚、葡萄糖、乙醇、氢氧化钠，来自国产分析纯。纤维素酶（4万U/g）购自山东龙元生物工程有限公司

（2）主要实验仪器设备

AL04型电子天平（梅特勒-托利多有限公司），V-1100D紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司公司），HH-2型水浴锅（浙江力辰仪器科技有限公司），THYD-500机械式小型超声波清洗仪（北京天佑恒达科技有限公司），G80F20CN2L-B8（R0）型微波炉（格兰仕）。

2．实验方案

在同等条件下，比较热水浸提法、纤维素酶提取、微波提取法、超声波辅助提取法对黑木多糖的影响。[3]

（1）热水浸提法

粉碎干黑木耳，用石油醚脱脂，取5.0g黑木耳粉，加入去离子水，通过水浴浸提，离心得上清液，用无水乙醇沉淀，离心，干燥得到粗多糖。黑木耳粉与水之比为1:50，在90℃水浴中抽提2h。

（2）纤维素酶法

取5.0g黑木耳粉，按照1∶50（g/ml）加入pH 5.0，0.05 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液，加入纤维素酶1 %（加酶量/木耳干重），50 ℃反应1h，用适量NaOH溶液调至中性，迅速升温至85℃，反应1h，4000 r/min 离心20 min，取上清液，用无水乙醇沉淀，4℃ 静置6 h，离心干燥得到粗多糖。

（3）微波辅助提取法

取5.0g黑木耳粉，加入去离子水，用微波处理，微波辐射功率为800w，辐射时间为40min，固液比（g：mL）为1:50，水浴浸提2h，离心得到上清液，用无水乙醇沉淀，离心，干燥得到粗多糖。（4）超声波辅助提取法

取5.0g黑木耳粉，加入去离子水，用超声波处理，水浴浸提2h，离心得到上清液，用无水乙醇沉淀，离心，干燥得到粗多糖。超声波功率40W、PH4.5、提取时间2h，提取温度45℃。

（5）黑木耳粗多糖纯化

取干燥粗黑木耳多糖称量后加蒸馏水（W:V=1:50）溶解，再加等体积0.1mol/l的溴化十六烷基三甲铵（CTAB）与硼酸-硼砂缓冲液充分混匀，静置，离心，沉淀用2mol/l乙酸溶解，离心，上清液加入等体积乙醇，静置24h离心，沉淀用乙醇洗涤两次，冻干即为纯化黑木耳多糖。

（6）黑木耳多糖提取率的测定。

1．葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取 0.1043 g 葡萄糖，溶解后定容于 250mL 容量瓶中，分别取 5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25mL、30 mL 溶液，配制不同浓度的葡萄糖溶液，以确保葡萄糖浓度与吸光度的关系为线性关系。

2．用苯酚硫酸法测定多糖，精确吸取多糖样品溶液2ml加入1ml苯酚溶液和5ml浓硫酸，其余同标准曲线之操作，测定吸光度值，由标准曲线计算样品溶液中多糖含量。[4]

多糖提取率（%）=C×V×N×100/1000W式中，C，比照标准曲线的多糖浓度（mg/ml），V，提取液总体积（ml），N，稀释倍数；W，黑木耳原料（g）。

二、实验结果与分析（不低于2000字，表格采用三线表格式，图片尺寸最大为：高650×宽120mm）

1．葡萄糖标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标制，做标准曲线得到图1

图1 葡萄糖标准曲线

2．不同方法提取香菇多糖的结果

不同方法提取多糖结果比较，表1

在相同的浸泡时间、相同料水比，下纤维素酶法、微波提取法、超声波辅助提取法所得的粗多糖的质量都高于热水浸提法，超声波辅助提取法所得的粗多糖质量最高0.588g，经纯化处理后多糖损失较多，纤维素酶法经纯化后纯化多糖含量最高，多糖得率最高达3.46%。其次是超声波辅助提取法，得率为2.96%，得率最低的是热水浸提法。由此结果可以看出纤维素酶提取方法由于其他三种方法。纤维素酶法与传统的热水浸提法相比具有条件温和，杂志易除和得率高等优点。

表1 不同方法提取多糖结果比较

确定纤维素酶法提取黑木耳多糖的最佳提取工艺，还需要进行单因素实验，如最佳温度、最佳料液比，最佳浸泡时间，最佳酶量都要进行实验才能得到最佳的提取方法。

结语

本实验采用不同方法浸提黑木耳得到粗多糖，然后采用相同工艺纯化粗多糖，结果表明用纤维素酶法从黑木耳中提取多糖，相对于其他方法提取的多糖纯度好，得率高，纤维素酶法浸提所得粗多糖经纯化处理多糖含量达93.24%，综合分析黑木耳多糖提取以纤维素酶浸提效果最佳。但在提取过程中有很多因素影响多糖的得率，例如加酶量，随着加酶量的增加，出现先增加后降的趋势，要选择最佳的加酶量，还要注意pH的影响，酶解时间的影响；由于真菌体内有水解酶共存，所以必须采用适当的方法破坏或者抑制酶的活性；黑木耳原料的粉碎情况对其多糖的提取有较大的影响。如果颗粒过大，多糖就不容易提出，如果粉碎过细，则比表面积反而减小，也不利于多糖的溶出；黑木耳多糖提取时，料水比要合适，过少，在没有达到最佳蒸煮时间之前，浸出液已经变得很少，甚至糊锅，从而影响多糖含量，若加水过多，则浸出液过多，不利于以后的分离浓缩。