依达拉奉对慢性间歇低氧大鼠前额叶生长相关蛋白43、Nogo-A表达的影响❋

韩晓庆 张盼盼 李 琳 张 敏 王 玲 王 袁 黄 超 刘 晨 王红阳

(华北理工大学附属医院呼吸科, 唐山 063000)

睡眠呼吸暂停低通气综合征其特征性缺氧在氧合过程中可产生大量氧自由基,使全身多个器官产生氧化应激反应,脑组织易受到自由基的攻击而发生变性[1]。有研究表明睡眠呼吸暂停低通气模式中低氧可以导致神经系统损伤,这可能与内质网应激相关蛋白表达有关[2]。作为神经元保护剂,依达拉奉在目前临床试验中证明不仅能够有效地清除氧自由基, 减少炎症介质释放,而且能够减少以氧自由基为中介的脂质过氧化造成的损伤。既往对依达拉奉的基础和临床试验研究多集中在缺血性脑病等范畴,而依达拉奉对于间歇低氧所致大脑神经损伤的保护作用鲜有报道。生长相关蛋白43(growth-associated protein 43, GAP-43)是神经元生长发育和可塑性的分子标记物,在引导轴突生长和调节轴突形成新的联系上起关键作用[3]。髓鞘相关生长抑制因子(myelin-associated inhibitor) Nogo-A是中枢神经系统髓磷脂中的一种抑制轴突生长的蛋白,但在慢性间歇低氧大鼠脑损伤中,对GAP-43、Nogo-A研究较少。本实验通过对Wistar大鼠慢性间歇性缺氧模拟睡眠呼吸暂停综合征,研究观察间歇低氧大鼠皮层GAP-43、 Nogo-A含量变化,探讨依达拉奉对慢性间歇低氧大鼠皮质神经细胞GAP-43、Nogo-A的表达影响,从而为临床上药物治疗睡眠呼吸暂停综合征造成的神经损伤提供用药依据。

1 材料和方法

1.1 动物

清洁级健康的成年雄性Wistar大鼠120只购于天津市山川红实验动物科技有限公司,许可证编号： SCXK(津)2009-0001,体质量为150g±10g。在华北理工大学动物实验室喂养,自由进食,室温控制在23℃±2℃,自然光照,在实验前适应喂养10d。

1.2 药物、试剂和仪器

低氧箱(长沙长锦科技有限公司)；程序控制及监测系统(唐山友谊科技有限公司)；无油润滑空气压缩机(型号： V-0.25/8,上海巨盛实业发展有限公司)；压缩空气净化器(型号： XL-02,浙江温岭市巨霸机械厂)；Leica UC6型超薄切片机(德国 Leica公司)。超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒及脂质氧化(MDA)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所),GAP-43、Nogo-A兔抗鼠多克隆抗体、内参GAPDH(北京博奥森生物技术有限公司)；PV6001试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 动物分组与模型

用随机数字表法将大鼠分为对照组、5%间歇低氧组、依达拉奉组,各组又分为3、7、14、21、28d时间亚组,每个时间亚组各8只。每天8∶00～15∶00时,将5%间歇低氧组和依达拉奉组大鼠置于相同的有机玻璃低氧箱内,根据间歇低氧条件循环交替给予不同流量氮气和压缩空气,120s为1个循环。连续给予氮气30s, 维持舱内氧浓度最低至5%, 随后均复氧至氧浓度21%；对照组持续充入压缩空气。由间歇低氧程序中的氧浓度检测盒及微量气泵检测并显示低氧箱内氧气浓度变化,保持低氧舱内氧浓度在5%～21%间循环。实验结束将实验动物取出,常规饲养, 自由饮水与摄食, 生活环境及饲养条件相同。分别在实验第3、7、14、21、28天结束后进行指标检测。

1.4 SOD、MDA测定

大鼠致死后,迅速取前额叶皮质区组织,称量0.8g,4℃PBS充分洗涤,加入 1ml 4℃全细胞裂解液,冰浴中匀浆,4℃离心15min,15000r/min,取上清。用 BCA法蛋白定量,并严格按照SOD、MDA试剂盒,分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定皮层组织SOD及MDA含量,用酶标仪测量光密度。

1.5 前额叶皮质GAP-43、 Nogo-A免疫组织化学检测

制备石蜡切片常规脱蜡至水,枸橼酸盐高压修复,滴加GAP-43、 Nogo-A(1∶200),湿盒中4℃过夜,IgG 抗体-HRP 多聚体(PV两步法),37℃温箱30min,DAB显色,脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片,取各组各时间点10张标本片在光学显微镜下以相同倍数(40×10)分别选取不同部位摄片,利用Image-Pro Plus医学图像分析系统分析,取相同面积阳性目标的积分光密度值(IOD)。

1.6 免疫印迹测定前额叶皮质GAP-43、 Nogo-A蛋白表达

大鼠致死后,迅速取前额叶皮质组织,称量0.8g,4℃PBS充分洗涤,加入1ml 4℃全细胞裂解液,冰浴中匀浆,4℃离心15min,15000r/min,取上清。用BCA法蛋白定量,取20μl 样品,10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜将蛋白转到PVDF膜上;脱脂奶粉封闭1h;将PVDF膜在鼠抗GAP-43(1∶50)、Nogo-A鼠抗(1∶50)、鼠抗GAPDH(1∶500)中孵育,4℃过夜。将PVDF 膜在羊抗兔二抗(1∶1000)中孵育2h;NBT/BCIP显色;用Image J软件分析系统分析条带的吸光度(A)值,GAPDH作为内部参照,每个样本重复3次,用每个样本的A值与各自内参A值的比值作为最后结果。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 SOD、MDA的变化

与对照组比较,5%间歇低氧组及依达拉奉组SOD活性下降,MDA表达含量增加(P<0.05)；与5%间歇低氧组比较,依达拉奉组SOD活性下降缓慢,MDA表达量减少(P<0.05)(表1)。

2.2 前额叶皮质GAP-43和Nogo-A的表达

光学显微镜下观察阳性细胞以胞质表达为主,胞质呈棕黄色。各组大鼠均有阳性表达细胞,但表达程度不同： 与对照组比较,GAP-43和Nogo-A表达于各个时间点均增加(P<0.05),于14d达峰值。与5%间歇低氧组比较,依达拉奉组GAP-43表达显著增加(P<0.05),于14d达峰值；依达拉奉组Nogo-A表达降低(P<0.05)(表2,图1)。

GAP-43和Nogo-A条带清晰,以GAPDH 的吸光度值作为内参照,以校准后的蛋白条带IOD 值反映其蛋白水平。结果显示： 与对照组比较,5%间歇低氧组于3、7、14、21、28d各时间点GAP-43、Nogo-A蛋白表达增高(P<0.05),于14d表达最强；与5%间歇低氧组比较,依达拉奉组各时间点GAP-43蛋白表达明显升高,Nogo-A蛋白表达下降(P<0.05)(图2、3)。

表1 各组大鼠前额叶皮质SOD活性和MDA含量变化比较

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vs5% intermittent hypoxia group

表2 各组大鼠前额叶皮质GAP-43和Nogo-A蛋白表达

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vs5% intermittent hypoxia group

3 讨论

SAHS是一种常见的睡眠障碍疾病,其特征性的缺氧方式是慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH),其过程类似于缺血再灌注,反复发生缺氧和再氧合,导致SOD和MDA分泌水平异常,破坏了氧化系统和抗氧化系统的平衡,导致氧化应激的发生,由于中枢神经组织含有丰富的脂质成分而且抗氧化酶相对缺乏、耗氧量高, 所以对氧化应激具有独特的易损性, 易导致脑损伤及海马等处神经细胞凋亡[4]。依达拉奉作为一种新型的自由基清除剂,不仅抑制羟自由基的活性,还能抑制脂质过氧化反应及铁离子诱导的过氧化损伤。本实验结果显示,依达拉奉组MDA含量增加较5%间歇低氧组缓慢,且SOD增加明显,说明依达拉奉作为氧自由基清除剂,一定程度上可能通过清除氧自由基,抑制氧化应激。

Nogo-A是在中枢神经系统外伤后具有轴突再生抑制作用的因子,被称为髓鞘相关蛋白。GAP-43蛋白是一种膜相关磷蛋白,主要表达于发育或再生轴突的生长锥末端,不仅参与轴突生长、突触重构以及儿茶酚胺和神经肽类物质的分泌[5],又间接抑制Nogo-A表达,从而阻止细胞凋亡,是神经再生表达过程中的一个典型特征,可随损伤的时空表象呈动态表达变化。本实验结果显示,正常组少见GAP-43阳性细胞,5%慢性间歇低氧组GAP-43阳性细胞数在3、7、14d逐渐增多,而依达拉奉组GAP-43阳性表达高于5%间歇低氧组,由此可以推测依达拉奉可能一定程度上促进了大鼠前额叶皮层神经轴突的再生,对损伤神经的恢复有一定效果。Nogo-A 是目前发现作用最为强烈的神经纤维再生抑制物质,在大鼠发育阶段的前脑表达明显；神经发育成熟后,Nogo-A在脑内呈低水平表达。研究表明慢性脑缺血后Nogo-A的强烈表达能够抑制因缺血刺激产生的新生颗粒细胞的轴突生长,导致神经元间的纤维联系受损[6]。Lackner 等[7]报道 Nogo-A 蛋白在实验性脑型疟疾小鼠中表达增加,考虑跟应激反应有关。Cheatwood 等[8]研究认为大脑中动脉缺血性卒中后 28d成年大鼠脑神经元Nogo-A蛋白的表达仍增加, Nogo-A蛋白是其抗体治疗的重要靶点。既往课题研究表明慢性间歇低氧引起大鼠齿状回Nogo-A表达水平增加,依达拉奉对重度间歇低氧的认知功能障碍有一定的治疗作用[9-10]。本研究显示,正常组大鼠脑组织中的Nogo-A处于较低的表达水平,5%间歇低氧组大鼠前额叶皮质Nogo-A表达增高,而依达拉奉组表达相对降低,由此说明依达拉奉可以下调Nogo-A的表达,有效解除神经再生抑制,促进神经元轴突再生。有研究表明大鼠脑缺血/再灌注损伤后Nogo-A蛋白表达增高,强烈抑制神经纤维的再生与联系,导致再生能力的减退,而GAP-43表达能够促进神经可塑性再生[11],孙建等[12]报道依达拉奉对认知障碍小鼠的海马神经元氧化应激有改善作用,可能是其提高学习记忆功能及促进海马神经元再生的基础。综上所述,慢性间歇低氧大鼠神经轴突再生功能的恢复,其机制可能涉及很多方面,依达拉奉通过抑制氧化应激,进一步上调GAP-43的表达,下调Nogo-A的表达,从而促进神经再生,增强神经可塑性可能是重要机制之一。由此可以为临床上治疗OSAHS引起的神经功能损伤提供一定的实验依据及理论基础。

图1 GAP-43和Nogo-A在前额叶皮质神经元中的表达变化,SP法,×400Fig 1 Changes of GAP-43 and Nogo-A in the neurons in the prefrontal cortex by SP method, ×400A-F： GAP-43, A： 7-day 5% intermittent hypoxia group; B： 14-day 5% intermittent hypoxia group； C： 28-day 5%

图2 各组大鼠前额叶皮质免疫印迹检测 GAP-43和Nogo-A蛋白水平表达

图3 各组大鼠前额叶皮质GAP-43 (A)和Nogo-A (B)蛋白表达柱状图