STEM理念下的中学生科学探究实践——低温和pH 值对微囊藻叶绿素a 及光合活性的影响*

章熙东 段志鹏

（南京外国语学校 江苏南京 210008）

“学始于问，才能终究成为学问。”光合作用作为地球上最有意义的合成代谢， 在高中生物学必修1 模块中占据重要地位， 是教师和学生公认的重、 难点， 可挖掘的素材多。 在该模块学习过程中，学生已不满足于“秋天叶片变黄是因为叶绿素容易受低温破坏”的问题解答，也不满足于“叶绿素作为天然色素不宜添加在酸性食品中”的答案呈现（2012 江苏小高考题目），学生更注重“低温和pH 值是如何影响叶绿素含量， 进而影响光合活性”的深度学习和过程体验，用问题唤醒问题。

STEM 教育目标是整合各领域知识、 技能，将知识的学习与师生生活实践结合起来， 通过科学探究的实践解决现实生活的实际问题， 培养创新型人才。 《普通高中生物学课程标准》明确指出生物科学教育的核心任务就是培养学生必备的、可持续发展的生物科学素养， 将STEM 整合到教学实践中，通过探究类学习，加深学生对生物学概念的理解，提升应用知识的能力。因而在笔者在所开设的《STEM 生物创新实验》选修课上，带领学生通过研究不同pH 和低温胁迫对微囊藻叶绿素a含量及光合活性的影响， 探讨蓝藻对不同胁迫的适应性反应及其生理机制，符合新课改理念，培养了学生的核心素养。

1 实验背景

光合作用是植物（包括藻类）最基本的生命活动，将光能转变为化学能，并以有机物形式储存。叶绿素在光合作用中起到吸收、传递、转化光能的作用，叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，反映植物生长状态。 干旱、低温、元素缺乏等外界因素都可以通过影响叶绿素的含量影响光合速率。 因此胁迫条件下的叶绿素含量测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。

光合活性表征的是藻细胞光合系统在一定条件下的状态，受到科学家普遍关注。 叶绿素荧光，作为光合作用研究的探针， 包含了许多光合信息，几乎所有光合作用过程的变化均可通过叶绿素荧光反映。 藻类细胞的光合活性通常可用叶绿素荧光表征体现，经过暗适应的藻细胞在低强度测量光条件下会发出初始荧光F0，经过饱和脉冲高光强后发出最大荧光Fm和Fv（最大可变荧光）。Fv/Fm表征的是暗适应下PSⅡ（光系统Ⅱ）反应中心完全开放时的最大光合速率。 在非胁迫条件下，此参数变化很小，但在胁迫条件下，此参数变化较大，反映PSⅡ内在机制的变化。 Fv/Fm常作为表达藻类光合活性是否受损的敏感性指标。 通常当藻类受到胁迫时，叶绿体中的光系统Ⅱ是首先而且也是主要损害的部位。 荧光测定技术不需破碎细胞，不伤害生物体，因此通过研究叶绿素荧光间接研究光合作用的变化是一种简便、 快捷、可靠的方法。

2 材料与方法

2.1 藻种选择 铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是蓝藻水华的主要藻种，喜温（25°C 左右）喜碱（pH 值为10 左右）环境，易聚集成团，对环境危害大。 实验用藻种购自武汉水生所的淡水藻种库（FACHB-469）。

2.2 实验方法 用0.1 mol/L 的HCl 和0.1 mol/L的NaOH 调节藻液的pH，将pH 值调整为3、6、12后静置30 min，低温组将藻液放置于4℃处理30 min，同时设置不处理组为对照组。 每组设置3个平行。

2.3 指标测定

1）叶绿素a 含量测定。将5 mL 藻液经玻璃纤维滤膜抽滤， 取出带有浮游藻类的滤膜后装入具塞玻璃试管中，加入5 mL 95%乙醇溶液，加塞后在4℃下浸提24 h。 将提取后的液体转入离心管中6 000 g 的离心速度下离心15 min， 收集上清液，将上清液在分光光度计上，用10 mm 光程的比色皿，分别读取664 nm、648 nm 波长处的吸光值，并以95%乙醇作为空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。

2）叶绿素a 含量计算。 叶绿素a 含量按如下公式计算［1］：Chla（μg／mL）＝13.36A664-5.19A648

3）光合活性测定。 取2 mL 藻液，暗适应20 min，采用叶绿素荧光仪（AquaPen-C AP-C100）测定藻细胞叶绿素a 荧光， 测得参数最大荧光（Fm）、最小荧光（F0）、可变荧光强度Fv（Fm-F0）、PSⅡ原初光能转换效率（Fv/F0）、PSⅡ的潜在活性（Fv/Fm）。

3 结果与分析

3.1 低温对叶绿素a 含量的影响 图1结果显示， 对照组叶绿素含量为4.48 μg/mL， 低温组为4.05 μg/mL，低温处理可以减少藻细胞的叶绿素a含量，但降低的幅度较小。低温可以抑制叶绿素合成有关酶的活性，从而影响叶绿素的生物合成；低温可能改变叶绿体的超微结构， 打破了叶绿素酶与其底物叶绿素在空间位置上的隔离从而促进了叶绿素的分解； 也可能通过影响某些同工酶的活性来影响叶绿素的合成和降解。此外，也可能是由于低温的诱导，使藻体中产生了一些新的蛋白质，这些新的蛋白质保持了脱镁螯合酶的活性从而促进了叶绿素的分解［2］。

图1 低温处理下叶绿素α 浓度变化

3.2 pH 对叶绿素a 含量的影响 通过分析发现，不同的pH 处理造成了叶绿素a 含量不同程度降低（图2），当pH 为12 和6 时，叶绿素含量为4.29 和4.13 μg/mL；pH 为3 时叶绿素含量为0.20 μg/mL，此时藻体合成叶绿素受到明显破坏。 藻类的叶绿素和其他生命物质一样，需经历合成和分解，在此过程中，藻细胞所处的环境对其是有影响的，例如光照等条件适应会促进合成， 反之则促进其分解［3］。叶绿素的生物合成过程中，绝大部分都需要酶的参与，pH 可能会影响到这些酶的活力， 从而影响叶绿素的含量。 pH 胁迫导致叶绿素含量的降低，从而降低了藻细胞捕捉和利用光能的能力，同时也影响了光能在叶绿体中的分配。

图2 不同pH 下叶绿素a 浓度变化（对照组为pH＝10）

3.3 低温对藻类光合活性的影响 Fv/F0和Fv/Fm分别反映PSⅡ反应中心内原初光能转化效率和PSⅡ潜在的光化学活性。 当藻类暴露在环境压力下时，Fv/Fm值降低，即表明有光抑制现象或环境压力使PSⅡ反应中心部分或全部受损， 抑制了光合作用的原初反应，阻碍了光合电子传递过程。 本实验结果中PSII 活性的抑制可以从快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和荧光参数看出（图3、图4）。结果表明，低温胁迫下，藻细胞的Fv/Fm和Fv/F0值明显降低（比对照组分别降低了16.0%和23.8%），反映出PSⅡ的原初光能转换效率和潜在活性减弱。 说明低温胁迫使藻类光系统PSⅡ活性中心受损，温度胁迫还可以使光合电子传递过程受抑制， 光合电子传递速率下降。

图3 低温处理下的快速叶绿素荧光诱导动力学（OJIP）曲线

图4 低温处理下荧光参数变化（对照组为20℃）

3.4 pH 对藻类光合活性的影响 如图5所示，荧光曲线的下降， 表明随着pH 值的降低荧光产量显著下降， 以及PSⅡ中QA、QB 和质体醌之间电子传递受到了抑制。pH 对藻细胞荧光参数的影响如图6所示。藻细胞的Fv/Fm和Fv/F0随着pH 值的降低显著下降， 说明强酸条件使藻细胞光系统PSⅡ活性中心严重受损，光合活性显著降低。

图5 不同pH 下的快速叶绿素荧光诱导动力学（OJIP）曲线

4 结论

温度和pH 值是影响酶活性的重要因素，进而影响蓝藻细胞内的叶绿素含量和光合活性。

1）低温对微囊藻叶绿素a 含量及光合活性造成了一定的影响，然而对其光合系统II 内部的质体醌和电子传递的影响不大。这表明，低温对微囊藻细胞的影响可能主要表现为降低了细胞生陈代谢的整体速率， 从而导致其叶绿素a 合成速率的降低及光合活性的下降。

2）微囊藻耐碱性能力远强于耐酸性能力。 这些结果可能为控藻技术的发展提供参考依据。

5 实验反思

生物学新课程标准要求让学生经历科学探究过程，习得科学研究方法，养成科学思维习惯，增强创新实践能力， 基于STEM 理念的实验教学恰恰提供了这样一个实践平台。 STEM 教育以设计和探索为手段，运用科学与数学的思想，通过应用技术手段，在解决实际问题中进行知识学习［4］。学生利用现有的多学科知识，在自主发现问题、尝试解决问题中进行新知学习，构建概念体系，发展科学素养，点燃了研究激情，完成了深度研究，唤起了新的问题。 “重实践”是新一轮课程改革所倡导的， 也是作为一线教师开展课程建设与教学改革的着力点和方向。