让病毒成为蛋白质分子的“展柜”——2018年诺贝尔化学奖简介之噬菌体展示技术*

葛逸盟 张玉莹 林怡婷 姚义凡 王雪珩 王月丹

（北京大学基础医学院免疫学系 北京 100191）

2018年10月30日， 瑞典皇家科学院宣布，将2018年诺贝尔化学奖的一半奖金授予美国科学家乔治·史密斯（G. Smith）及英国科学家格雷戈里·温特尔爵士（Sir G. Winter），以表彰他们在发明及应用噬菌体（phage）展示技术中作出的贡献［1］。什么是噬菌体展示技术？这个技术对人类的重要性究竟有多大？

1 噬菌体与噬菌体展示技术的发明

从字面含义上看，噬菌体是指能“吃掉”细菌的病毒，即一类能感染细菌、真菌、放线菌及螺旋体等微生物的病毒的总称［2］。噬菌体的体积很小，形态因种类不同而存在差异，一般多为蝌蚪形，也可呈微小的球形或细长杆状。 大多数噬菌体为有尾巴的二十面体结构（图1），也有部分噬菌体没有尾部结构。 其中，衣壳蛋白规律排列组成了噬菌体二十面体的头部， 其中含有遗传物质——核酸。 而丝状噬菌体外形呈线状，没有明显的头部结构，其衣壳蛋白颗粒组成的盘旋状结构形成了外壳，包裹着噬菌体的核酸。

图1 噬菌体的模式图

目前， 根据基于病毒基因测序的噬菌体蛋白组树（phage proteomic tree，PPT）分类法，可将噬菌体分为光滑噬菌体、囊状噬菌体、丝状噬菌体、微小噬菌体、短尾噬菌体、长尾噬菌体、肌尾噬菌体和Fuselloviridi 等8 种［3］（表1）。 1915年英国微生物学家托特（Federick William Twort）首先在金黄色葡萄球菌的培养中， 观察到了噬菌体杀死细菌的现象［2］。作为细菌的天敌，噬菌体很快就被用于对抗细菌感染的治疗中。 1919年，人们采用噬菌体疗法在法国治疗儿童痢疾取得了成功［4］。 后来人们又相继发现，噬菌体可感染霍乱弧菌和炭疽芽孢菌等多种病原细菌， 并可将这些宿主病原菌裂解，成为治疗这些病原菌感染相关疾病的特效药物，成为抗感染治疗的有效方法之一。随着抗生素的发明和使用，利用噬菌体进行治疗细菌感染的方法一度陷入低谷。但进入21 世纪以来，因为细菌对抗生素产生耐药的问题越来越严重，噬菌体治疗再次进入了人们的视野，并在耐药细菌和条件性致病细菌感染的治疗中取得了初步的胜利［5］。

这次噬菌体成为诺贝尔化学奖的关键词，却不是因为其抗菌的作用， 而是因为有人将其变成了能够展示外源性基因片段编码蛋白及其功能的“展柜”。 1985年，乔治·史密斯首先在Science杂志上发表了题为《丝状融合噬菌体：可以在病毒表面表达克隆抗原的新表达载体》的文章（图2）。 这标志着一种可用于大规模高通量蛋白质之间相互作用研究（特别进行抗原表位和特异性抗体的筛选与鉴定）的新型表达载体系统诞生了［6］。在此基础上，以格雷戈里·温特爵士为代表的科学家将其应用于抗体的人源化改造等生物学领域的研发中， 极大推进了疫苗和基因工程化抗体等新型生物制品研发的进展， 使抗体技术在继杂交瘤技术和嵌合抗体技术之后， 进入了第3 次技术革命阶段， 越来越多的抗体药物逐渐进入了临床治疗应用的选择范围中［7］。 这也是温特尔爵士能成为本次诺贝尔化学奖分享者的充分理由。

图2 乔治·史密斯1985年在Science 杂志上发表的第1 篇噬菌体展示技术论文的杂志封面及目录

2 噬菌体展示技术的原理及常用系统类型

为什么小小的噬菌体能成为展示各种外源性蛋白片段， 以及成为筛选抗原表位和特异性抗体的好工具？ 原来，人们可通过基因工程技术，将噬菌体中编码衣壳蛋白信号肽的基因和衣壳蛋白多肽的基因切开， 将编码外源性多肽或蛋白质的基因片段插入到二者之间， 从而使外源性的多肽或蛋白质序列与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白分子，在信号的引导下，表达于噬菌体的表面。 此过程称为“展示”（图3）。由于噬菌体体积微小，表达在其表面被展示出来的外源性多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构及生物学活性， 从而可通过适当的淘选方法得到与靶分子亲和性最强的可结合序列，并用于各种筛选、鉴定及生物学功能的研究与实践中。

图3 噬菌体展示系统的模式图

一般制备表达特异性蛋白质或多肽的噬菌体并进行筛选的方法分为以下几步：

①制备大量噬菌体克隆的展示文库， 每个噬菌体表面展示一种特定的蛋白质或多肽。

②以展示文库为流动相， 以目的多肽或蛋白质分子作为固定相， 使两相相互接触并发生相互作用。

③用缓冲液洗去不能与靶分子特异性结合的噬菌体，保留可以与靶分子特异性结合的噬菌体。

④将收集到的噬菌体用于侵染大肠杆菌进行进一步扩增， 产生一个富集池作为新一轮淘洗的展示文库。

基于类似的展示原理， 科学家曾尝试使用细菌（以大肠杆菌为例）［8］、酵母［9］或直接编码质粒DNA（肽键质粒文库）［10］作为蛋白质或多肽分子的表达载体。 但由于这些系统仍然有赖于宿主细胞的转换，它们并没有成功地构造出大量、多样性的表达 文库［11］。

噬菌体展示技术模拟了自然选择过程， 能快速、 有效且经济地实现对靶分子特异性受体筛选的高通量选择，并首次实现了将基因型与表型，以及分子结合活性与抗原可扩增性的结合。 在随后20 世纪90年代新型治疗学的研发中发挥了重要作用。 基因型-表型连锁还可通过对噬菌体基因组中特定插入物的DNA 测序，快速确定特定结合肽或蛋白质分子的氨基酸序列［11］。

迄今为止， 人们已开发了丝状噬菌体展示系统、T4 噬菌体展示系统， 以及λ 噬菌体展示系统等多种不同的噬菌体展示系统。

丝状噬菌体展示系统是最早被发明和应用的噬菌体展示体系。丝状噬菌体的基因编码pⅧ、pⅢ、pⅥ、pⅦ和pⅨ等5 个衣壳蛋白， 其中pⅧ和pⅢ是最常用的展示蛋白（图3）。 丝状噬菌体载体较为稳定，但转化效率较低。如果展示的蛋白片段过大， 则会进一步降低pⅢ蛋白与大肠杆菌的性纤毛之间的相互作用， 使其感染宿主大肠杆菌的能力进一步下降， 需要通过应用辅助噬菌体等方法进行改善［12］。

T4 噬菌体展示系统是一种比较常用的展示系统。在进行展示的时候，人们一般将外源性蛋白片段与T4 生命非必需衣壳蛋白SOC 和HOC 融合，这2 个蛋白分布于噬菌体的正二十面体表面，具有很多拷贝， 且不影响T4 噬菌体的衣壳组装，是良好的展示蛋白结构。 同时，T4 噬菌体基因组为线性双链DNA，在宿主细胞内组装成为病毒颗粒。在此过程中，展示蛋白不需要通过质膜和细胞分泌过程，因此，可广泛应用于包括不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白在内的各种多肽和蛋白质的展示研究。

λ 噬菌体具有两端不闭合的线形双链DNA组成的基因组， 外源性多肽或蛋白质主要基于其头部的D 蛋白和尾部的V 蛋白进行展示，这2 个蛋白在噬菌体上的拷贝数分别为405～420 和192个，能对外源性多肽或蛋白质进行多拷贝的表达。λ 噬菌体不仅在宿主细胞内完成组装， 无需分泌过程，且该系统还能展示100 kD 以上的活性蛋白大分子及对宿主细胞具有毒性蛋白质。同时，凭借D 蛋白的分子伴侣作用，λ 噬菌体系统还能在大肠杆菌等原核细胞中， 高水平表达和展示多种具有生物学活性的真核细胞蛋白质。

3 噬菌体展示技术的应用与展望

噬菌体展示技术自诞生以来， 被广泛应用于各个生物医药领域的研究与开发之中。其中，抗体药物的研发是噬菌体展示技术最为令人瞩目的成就。 2002年，通过噬菌体展示技术，人们成功开发了完全人源化的抗肿瘤坏死因子单克隆抗体——阿达木单抗（Adalimumab，商品名为修美乐），用于类风湿性关节炎和炎症性肠病等自身免疫性疾病的治疗［13］。 目前，该药已在全球96 个国家上市销售，覆盖的适用病种达到了14 个，其2017年的销售额更是高达180 多亿美元， 是目前世界上最为畅销的药物。

此外，因具有简便、有效和易于控制等优势，噬菌体展示技术还在各种病原体（包括病毒、细菌和寄生虫）感染机制的研究、新疫苗的研发、肿瘤免疫过程的探索、 自身免疫性疾病的诊断与治疗等应用领域，以及蛋白质相互作用、细胞信号转导和蛋白质组学等基础研究中， 发挥了极为重要的应用与研究价值， 是解决这些生物医学问题必不可少的科学工具。

目前，噬菌体展示技术还存在着库容有限、长片段表达易发生结构的随机折叠而影响生物活性， 以及宿主菌对氨基酸修饰的障碍等问题［14］。因此，人们在该技术的基础上，又进一步开发出了核糖体展示技术［15］和酵母蛋白展示系统［16］等有针对性的解决方案。 随着现代生物医学技术的不断发展与进步， 该系统自身也将会得到不断的改进与完善，最终为维护人类的生命健康，提供源源不断的新思路与新发现。