局部超声效应对甜橙皮渣总酚提取及其抗氧化性的影响
2018-10-10震马亚琴王鹏旭成传香朱攀攀
张 震马亚琴王鹏旭成传香朱攀攀
(1. 西南大学柑桔研究所,重庆 400712;2. 国家柑桔工程技术研究中心,重庆 400712)
酚酸很少以游离态的形式存在,通常与有机酸、糖以及各种酯以结合态形式存在,是具有抗癌、抗肿瘤、抗菌、抗氧化性等的一类生物活性物质。因此,有效提取酚酸类物质是目前的研究热点。柑橘果实富含酚酸类物质,且果皮中酚酸含量高于果肉,柑橘皮中酚酸类物质的提取已有不少研究报道。Nayak等[1]比较研究了传统溶剂提取、加速溶剂提取、微波辅助提取、超声辅助提取柑橘皮中酚类物质。Hiri等[2]在不同的提取条件下研究了微波、超声、超临界二氧化碳、高压等方法处理橙皮对其总酚和单个酚酸组分的影响,发现超声波和微波处理后酚酸提取量最高,由于超声波在低温条件下能有效提取热不稳定性组分并保持提取物的品质,因此,在未来更具应用潜力;超临界CO2萃取法处理后酚酸提取量最低,但提取过程中有机溶剂的使用量最小,环保性较好;高压处理后造成总酚含量的降低,这可能与酶的氧化以及酚酸分子结构发生变化引起酚酸降解有关。Luengo等[3]研究认为应用脉冲电场技术提取甜橙皮渣中的多酚具有潜在的优势,不仅能提高其抗氧化能力,缩短提取时间,而且不使用有机溶剂提取,有利于环保。
目前,利用局部超声场对柑橘皮渣总酚和抗氧化性影响的研究尚未见报道。本研究通过划分超声水浴槽的空间位置(图1),系统地研究水浴槽不同位置产生的空穴效应对总酚提取量及其抗氧化性的影响,旨在明确局部超声场中超声能量的分布特性,为优化超声提取工艺提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验原料与试剂
甜橙皮渣:原料长叶橙,皮渣来自西南大学柑桔研究所,50 ℃烘箱烘干,过筛得到80目粒径的样品,在4 ℃条件下贮藏备用;
福林酚试剂:北京鼎国试剂公司;
2,4,6-反式-2-吡啶基三嗪 (TPTZ)、6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸 (Trolox)标准品:美国Sigma公司;
其他试剂均为分析纯。
1.2 试验仪器和设备
超声波提取设备:DP-800型,上海生析超声设备有限公司;
电子分析天平:FAZ004B型,上海精密仪器有限公司;
紫外可见分光光度计:TU-1901型,北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 试验设计
1.3.1 超声波处理 准确称取2 g长叶橙皮渣干样粉末,置于250 mL三角锥瓶中,按l∶20(g/mL)的料液比加入40 mL 60%乙醇。选定超声频率25 kHz的超声波进行超声处理,超声换能器在水槽底部的分布情况见图2。物料距水槽底部10 cm,超声波处理过程中水槽水位高度为14 cm,整个试验水位高度保持一致;此外,设定的超声位置与换能器的距离以水槽4个角的顶点和水槽中心点与超声换能器中心点的距离计算。超声处理后滤纸过滤并收集滤液放置在-20 ℃冰箱备用。
1.3.2 单因素试验设计
(1) 超声温度和超声时间:固定超声功率800 W,超声位置 P5,考察在3种超声温度(15,30,40 ℃)条件下,超声时间(10,20,30,45,60 min)对总酚含量和抗氧化能力的影响。
(2) 超声位置:固定超声功率 800 W,超声温度 30℃,超声时间 10 min,考察超声位置(P1,P2,P3,P4,P5见图1)对总酚含量和抗氧化能力的影响。
(3) 超声功率:固定超声温度30 ℃,超声位置 P5,超声时间10 min,考察超声功率(320,480,640,800 W)对总酚及抗氧化能力的影响。
1.3.3 总酚(TPC)测定 根据文献[11],修改如下:准确移取0.25 mL提取液于25 mL容量瓶中,加入蒸馏水9.75 mL,再加入0.5 mL福林酚试剂并充分振荡后静置5 min,接着加入6%的Na2CO3溶液 5 mL,最后蒸馏水定容至25 mL充分振荡后避光放置30 min,在760 nm处测定分光光度吸收值。用0.25 mL蒸馏水代替提取液,按上述步骤即得空白。样品中的总酚含量用每克干物质含有的毫克当量的没食子酸含量来表示。
图1 超声波设备示意图Figure 1 Schematic diagram of the ultrasonic apparatus
图2 超声换能器分布图Figure 2 Schematic diagram of sonochemical reactors for ultrasonic irradiation at 25 kHz
1.3.4 抗氧化性测定 参照FRAP法[12-13],将0.1 mL提取液与2.45 mL FRAP工作液充分混合,避光反应30 min,在593 nm处测定吸收值。空白以0.1 mL 80%甲醇代替提取液与2.45 mL工作液混合均匀,其他步骤同样品处理,空白校零,抗氧化能力用每克样品当量的Trolox (TEAC)表示。
1.4 数据分析
测得的试验数据以(x±s)来表示。以Excel和Origin9分析软件结合进行分析,方差分析(ANOVA)通过SPSS (Version 20.0.0)完成,P<0.05水平上为显著性差异。
2 结果与分析
2.1 超声温度和提取时间对总酚含量的影响
由图3可知,超声温度和提取时间对长叶橙皮渣中总酚含量的变化有显著性影响(P<0.05)。不同温度水平,随超声时间的延长,总酚含量的变化表现出不一致性。在温度为15 ℃时,总酚含量随超声时间的增加表现出先减小再增加的趋势,超声处理45 min时总酚含量达到最高。在3种温度条件下,30 ℃处理后总酚含量最高。在40 ℃时,当超声时间从20 min 延长至45 min时总酚含量增加了21.37%,该温度下总酚含量随时间的变化差异性最为显著(P<0.05)。综上可知,30 ℃超声处理45 min,总酚含量最高。此外,超声温度和提取时间可能存在叠加或互作效应,30 ℃时超声时间从10 min增加到60 min其总酚含量一直呈增加趋势,但在40 ℃,超声处理45 min时总酚含量达到最大,之后随着超声时间延长总酚含量反而降低。利用超声波提取咖啡渣中总酚的研究也得到相似的结果,提取温度高于45 ℃,提取时间超过36 min总酚含量下降[14]。说明酚酸对高温敏感,遇热不稳定,在低温条件下超声波具有较强的提取优势,表明利用超声波辅助提取热不稳定性生物活性成分有潜力。另一方面,总酚中的类黄酮物质不仅含量比酚酸高而且有较好的热稳定性,超声处理后,总酚含量可能与类黄酮具有相同的变化趋势[15]。
2.2 超声位置对总酚含量的影响
超声位置作为一个重要的超声参数,在以前的文献中却鲜有报道,这是因为很多超声增强的研究并未关注到超声场的不均一性。超声位置对提取效果的影响是基于在超声场的不同超声位点其超声强度不同而产生的。本试验采用水浴式超声波,整个水域槽即是超声场,超声处理过程中水浴槽内水位的高度保持一致。不同超声位置上,超声场中的超声化学效应具有显著性差异,从P1到P5位置(如图4所示),总酚含量呈上升趋势,P5位置总酚含量最高,说明P5位置可能是超声槽的活性区域,该区域更有利于长叶橙皮渣中酚类物质的提取。超声活性区域是指具有较强的超声化学效应(机械效应,热效应,空穴效应),通常超声活性区域与超声换能器的位置有关,相关研究[16]已表明有效的超声能量存在于超声换能器附近,并随中心轴距离的增加而衰减或吸收。
图3 在P5位置不同温度水平超声提取对总酚含量的影响
图3 Effect of ultrasonic extraction on TPC of extracts from Changye orange peels at temperature level of 15, 30, 40 ℃ with 800 W at the position of P5
图4 超声位置对总酚含量的影响
图4 Effects of local positions on TPC f extracts from sweet orange peels at 30 ℃ with 20 min
2.3 超声功率对总酚含量的影响
由图5可知,超声功率对总酚含量有积极的影响。超声功率从320 W升高至640 W 时,总酚含量增加了13.12%,增幅较大,可能是超声功率的增加使局部区域范围内作用于提取物的超声化学效应增强。其中超声波机械效应有利于长叶橙皮细胞壁的破坏,使酚类物质溶出更多,同时超声空穴效应产生的高温高压和强烈的冲击作用加速了酚酸类物质的溶出。此外,超声波强度越大,热作用越强,加速了酚酸类等分子的热运动,总体表现出总酚含量随超声波功率的增加而升高。从640 W 升高至800 W时,总酚含量增加了1.86%,增幅变小。随着超声功率的增加,超声处理过程中可能产生的热损耗和散射能量随之增加,最终导致作用于组织内部的能量相对减少[18],与前期研究[19]结论一致。
图5 超声功率对总酚含量的影响
图5 Effects of ultrasonic power on TPC of extracts from sweet orange peels at 30 ℃ with 20 min in position of P5
2.4 局部超声处理对抗氧化能力的影响
超声处理对长叶橙皮渣中抗氧化性的影响见图6。图6表明提取物的抗氧化性在超声时间、提取温度、超声能量、超声位置4个超声参数的作用下均有显著变化。比较图3和图6(a),超声处理对总酚提取及其抗氧化性的影响趋势非常相似,在相对较低的温度(15 ℃)条件下,抗氧化能力随着超声时间的延长而增加,在相对较高的温度(40 ℃)条件下,超声处理45 min后,总酚含量和抗氧化能力均下降,可能是高温易造成酚酸降解引起的,但总酚的抗氧化能力在低温条件下超声处理更有效。当超声能量从320 W增加到800 W时,抗氧化能力增幅达到了13.6%。Singanusong等[20]的研究认为超声处理能有效地增强柑橘皮提取物抗氧化能力,宽皮柑橘皮提取物抗氧化能力比酸橙高3倍多,丙酮提取物抗氧化能力比甲醇和乙醇都高,并且80%丙酮提取物抗氧化能力最高,测定的FRAP值为2521.47 mg /100 g DW。而超声处理金诺橘皮得到80%甲醇提取物的抗氧化能力最强,其FRAP值为(42.06±1.11) mg/g[21]。不同研究报道柑橘皮提取物FRAP值的差异很可能是柑橘品种、溶剂类型、溶剂浓度以及超声设备型号的不同而造成的。
长叶橙皮总酚抗氧化能力随超声位置不同而存在差异,但与总酚影响趋势基本一致。在超声槽的P5位置抗氧化能力最强,因此,在超声提取过程中,选择有效的超声区域有利于从根本上提高提取效率。
2.5 局部超声场处理后总酚与抗氧化相关性比较
局部超声区域超声处理长叶橙皮渣总酚含量与其抗氧化能力相关性见图7。图7表明总酚含量与TEAC值有良好的线性关系。总酚含量越高,其对应的抗氧化能力越强。15,30,40 ℃温度水平(分别超声10,20,30,45,60 min),不同超声位置(P1,P2,P3,P4,P5)和不同超声功率处理,R2依次是0.708 3,0.746 9,0.718 9,0.971 2,0.735 0,其中不同超声位置上处理R2最大,说明超声位置能显著影响酚酸类物质的提取和抗氧化性(P<0.05)。以上结果表明,总酚含量与其FRAP值存在一定正相关[22-24],有效的超声波处理能显著提高长叶橙皮酚类物质的抗氧化性。
图6 超声提取对总酚提取物抗氧化性的影响
图6 Effects of ultrasonic extraction on antioxidant ability of ethanol extracts from Changye orange peels
图7 总酚和抗氧化性的相关性Figure 7 Correlation between TPC and TEAC yield
3 结论
本研究结果表明局部超声效应能有效地增强长叶橙皮渣中总酚含量和抗氧化能力。随着超声温度和提取时间的增加,当设定超声温度30 ℃,提取时间45 min,超声槽P5位置及超声功率800 W时,总酚含量达到最大(8.03 mg/g)。同时,总酚含量与其抗氧化性有良好的线性关系,在15,30,40 ℃温度水平,不同超声位置和不同超声功率条件下,R2依次是0.708 3,0.746 9,0.718 9,0.971 2,0.735 0,表明局部超声效应显著影响酚酸等活性物质的提取和其抗氧化性。基于上述试验数据进一步证实了超声场的不均一性,明确了超声换能器的分布是影响超声能量多寡的主要影响因素。在超声处理过程中,总酚含量和抗氧化值随超声时间和温度梯度的变化均未与其完全呈直线关系,而是产生一定波动,可能与局部超声场的时空动态变化有关,其具体时空动态特性还有待深入研究。