利用PCR-SSCP方法检测滩湖杂交羊F2代FecB基因

于 洋 ，梁小军 ，高蕙兰

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002；2.宁夏固原市原州区动物疾控中心，宁夏 固原 750003）

FecB基因是在绵羊中识别出的第一个高繁殖力主效基因。近年来研究发现，湖羊存在FecB基因，即BMPR-ⅠB基因突变。滩羊是我国特有的轻裘皮用单羔绵羊品种，繁殖力低下是限制滩羊生产性能发挥的主要因素之一。为了合理利用滩羊的种质特性，同时发挥湖羊多胎高产的优势，以滩羊为父本、湖羊为母本，再以滩湖F2代为母本、滩羊为父本进行杂交，得到滩湖杂交羊F2代。该研究借鉴已报道的绵羊多胎主效基因FecBPCRSSCP检测方法［1］，对滩湖杂交羊 F2代血液样本中的FecB基因进行分析，以期为生产实践中采用常规表型选择育种方法与FecB基因分子标记辅助选择育种技术相结合的方式开展滩羊多胎品种（系）的培育工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取滩湖杂交羊F2代549只，其中，282只来自平罗宁羊发展集团，267只来自宁夏朔牧盐池滩羊繁育有限公司。每只羊颈静脉采血3～5 mL，用1%肝素钠抗凝，-20℃冻存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 绵羊全血DNA提取及检测：使用天根全血基因组DNA提取试剂盒提取绵羊全血DNA，通过分光光度计与0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果。

1.2.2 引物序列：预期扩增产物大小为187 bp。上游引物序列为：AGATTGGAAAAGGTCGCTATG，下游引物序列为：ACCCTGAACATCGCTAATACA。

1.2.3 FecB基因PCR扩增体系及条件：PCR扩增体系为 20 μL， 其中，PCR Master Mix 10 μL，DNA模板（100 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.2 μL，使用 ddH2O 补至 20 μL。PCR 扩增条件为：95℃预变性 5 min；95℃变性 40 s，65℃退火45 s，72℃延伸 45 s，33个循环；72℃最后延伸5 min；4℃保存。

1.2.4 PCR产物检测：使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

1.2.5 PCR-SSCP分析：聚丙烯酰胺凝胶的制备采用常规方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：吸取 2 μL PCR扩增产物与7 μL变性缓冲液混合；98℃变性10 min，取出后冰浴7 min完成变性；切断电泳槽电源，将已变性的混合液用10 μL移液器准确点入每个胶孔中，静置约10 min，使样品全部下沉；然后接通电源，在15 V/cm恒定电压下电泳 5～10 min，观察到溴芬兰（深蓝色）和二甲苯氰（蓝绿色）两条带分开后，在5～7 V/cm恒定电压下电泳 16 h。

聚丙烯酰胺凝胶银染染色液配制采用常规方法。聚丙烯酰胺凝胶染色过程如下：①洗胶：电泳40 min结束后，将凝胶小心取下放入超纯水中60 r/min漂洗2 min；②染色：将漂洗后的凝胶放入500 mL染色液中，60 r/min漂洗30 min，然后用水漂洗30 s；③显色：将染色后的凝胶放入500 mL显色液中，60 r/min漂洗约20 min后出现棕色条带，然后用水漂洗30 s；④固定：将显色后的凝胶放入500 mL固定液中，60 r/min漂洗 2 min，保留条带，将保留条带的胶置于白板上，用凝胶成像仪拍照。

2 结果与分析

2.1 全血DNA提取检测结果

提取的绵羊血液基因组DNA的OD值在1.7～1.9。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，提取的基因组DNA质量良好、无降解，可直接用于后续 PCR扩增（见图1）。

图1 绵羊全血DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2 FecB基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果

2.2 FecB基因PCR产物检测

由图2可知，利用1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，得到的产物大小约为187 bp，与预期结果一致，表明扩增得到了目的产物。

2.3 FecB基因的PCR-SSCP分析

对FecB基因的PCR扩增产物进行SSCP分析，结果表明，不同绵羊个体表现出2种基因型，即 B+型和++型（见图 3）：条带 1～3表示携带 1个FecB基因拷贝，即B+型；条带4～6表示不携带FecB基因，即++型。

图3 FecB基因的PCR-SSCP分析结果

2.4 FecB基因的等位基因频率和基因型频率

滩湖F2代绵羊群体中FecB基因的等位基因频率和基因型频率见表1。由表1可知，检测的滩湖杂交羊F2代群体中不存在BB基因型；在选自宁夏朔牧盐池滩羊繁育有限公司的绵羊群体中（n=267），等位基因B的频率为28%，等位基因B+的频率为 72%，B+基因型的频率为 55%，++基因型的频率为45%；在选自平罗宁羊发展集团的绵羊群体中（n=282），等位基因 B的频率为 24%，等位基因 B+的频率为 76%，B+基因型的频率为48%，++基因型的频率为52%。2个群体综合来看（n=549），BB基因型不存在，等位基因B的频率为26%，等位基因B+的频率为74%，B+基因型的频率为52%，++基因型的频率为48%。

3 讨论

Southey 等［2］研究表明，1 个 FecB基因拷贝能够增加母羊排卵数1.6枚，携带1个FecB基因拷贝的母羊产羔数增加0.65只。马丽娜等［3］研究发现，FecB基因能有效提高滩羊个体的平均产羔数，且产羔数随Y等位基因的增加而增加。李国忠［4］建立了低丰度FecB基因COLD-PCR HRM检测方法，适用于绵羊FecB基因的大规模快速筛查工作。李东红等［5］研究表明，小尾寒羊、湖羊、湖寒杂交羊FecB基因均有 BB、B+、++3个基因型，在 746 bp处发生 A→G的突变。罗生金［6］研究表明，含FecB基因的羊与哈萨克母羊杂交后，FecB基因显性效果好，遗传性能较为稳定，进一步说明FecB基因是高繁殖率主效基因，可有效提高F1代羊的产羔数。马吉锋等［7］研究发现，滩湖 F1代BB基因型个体占6.67%，但该基因型在F2代中未检测到。额尔和花等［8］对 80只滩湖杂一代绵羊进行了FecB基因检测，发现该群体中BB基因型个体占66.7%。

表1 滩湖F2代绵羊群体中FecB基因的等位基因频率和基因型频率计算结果%

该试验应用PCR-SSCP方法对549份滩湖杂交羊F2代血液样品中的FecB基因进行了检测，发现BB基因型在滩湖F2代群体中不存在。如果采用基因检测技术能够将含有B基因的个体选留下来，将有利于提高群体的B基因频率。下一步可以通过利用基因型选育技术，结合传统选种方法，选留B+基因型的公母羊交配，可显著改善滩羊FecB基因的基因型结构和基因频率，提高群体的产羔数，加快滩羊高繁品种（系）的建立。