柴芍乳癖颗粒对乳腺增生模型大鼠血清激素水平和乳腺组织中VEGF和bFGF蛋白表达水平的影响及其意义

楚爱景，程旭锋，赵慧朵，王丰莲

(河南中医药大学第一附属医院乳腺外科，河南 郑州 136300)

乳腺增生病为乳腺常见病和多发病，是以乳房的疼痛或肿块为主要临床表现的一种既非肿瘤又非炎症的良性改变，其发生与体内激素失调有关，被认为是乳腺癌癌前的1种良性病变，占女性全部疾病发病率的50%～70%，对女性的生命健康产生严重威胁[1-2]。乳腺增生属于中医学疾病乳中结核、乳癖的范围，并认为主要病机是气滞和痰凝引起瘀血，在乳房部相互凝结，引发乳癖的发生[3]。中药治疗乳腺增生病的历史由来已久，柴芍乳癖颗粒由柴胡、白芍、党参、白术、茯苓、郁金、三七、当归、瓜蒌皮、浙贝母、王不留行、丹参和蒲公英等多味中药组成，诸药合用，共奏疏肝理气、活血化瘀、散结止痛和健脾益气之功。研究[4-6]显示：柴芍乳癖汤能在一定程度上控制乳腺增生症状，可以明显改善乳腺增生兔模型B超声像，减轻雌兔乳腺增生程度，临床上柴芍乳癖合剂可明显改善乳腺增生患者的疼痛及全身伴随症状，但目前尚无有关柴芍乳癖颗粒对乳腺增生组织产生影响的相关机制研究。因此，本研究通过探讨柴芍乳癖颗粒对乳腺增生大鼠血清激素水平和乳腺组织中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生成因子(bFGF)蛋白表达水平的影响，阐明其作用机制，为其进一步实验研究以及临床推广提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品、试剂和主要仪器 雌性SD大鼠60只，SPF级，体质量为200～220 g，9周龄，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(鄂)2010-0009。苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)，黄体酮和他莫昔芬片(上海复旦复华药业有限公司)，柴芍乳癖颗粒(一方中药配方颗粒，由湖南中医药大学第一附属医院提供)，雌二醇(E2)、孕酮(P)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、催乳素(PRL)、促性腺激素释放激素(GnRH)、VEGF和bFGF检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。病理组织切片机(德国Sartorius 公司)，Leica DMI4000B 倒置荧光显微镜(德国Leica公司)，Jouan BR4I 高速离心机(德国Hereaus 公司)。

1.2 实验动物分组和动物模型制备 60只大鼠随机分为6组，每组10只：对照组，模型组，他莫昔芬组(4 mg·kg-1)，低(0.45 g·kg-1)、中(0.90 g·kg-1)和高(1.80 g·kg-1)剂量柴芍乳癖颗粒组。对照组大鼠腹腔注射生理盐水0.05 mL，常规喂养，其余各组大鼠均腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1，连续25 d；然后腹腔注射黄体酮注射液5 mg·kg-1，连续5 d，建立大鼠乳腺增生动物模型[5]。对照组和模型组大鼠灌胃等体积蒸馏水，其他各组分别灌胃相应剂量的药物，连续给药8周。

1.3 大鼠乳头直径和高度测量 用游标卡尺精确测量大鼠第2对乳头直径和高度，并观察其外观。

1.4 血清采集和指标测定 10%水合氯醛按腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，4℃、3 000 r·min-1离心10 min，取血清，采用ELISA法检测血清中E2、P、LH、FSH、PRL、GnRH、VEGF和bFGF的水平。

1.5 免疫组织化学法检测大鼠乳腺组织中VEGF和bFGF蛋白表达水平 无菌条件下，大鼠10%水合氯醛麻醉固定，摘下大鼠第2对乳房，于4%多聚甲醛固定，制作病理切片，HE染色，显微镜下观察各组大鼠乳腺组织病理形态表现(每组选取染色清晰的图片并用图像分析系统拍片)；免疫组织化学法：依次滴加一抗、生物素化山羊抗大鼠IgG，DAB显色，检测各组大鼠乳腺组织中VEGF和bFGF的表达情况，采用Image ProPlus 6.0软件测量每张片子阳性蛋白染色面积的平均吸光度(A)值，以A值代表VEGF和bFGF蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠乳头直径和高度 对照组大鼠乳头仅呈小米样，柔软，紧贴于皮肤上，乳头高度和直径无明显变化；与对照组比较，模型组大鼠乳头竖起较坚实，充血，乳头高度和直径明显增加(P<0.05)。与模型组比较，他莫昔芬组和低、中和高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠乳头高度和直径均明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠乳腺组织病理形态表现 与正常组比较，模型组大鼠乳腺组织中腺泡形状不规则、分泌物增多、细胞明显增生；与模型组比较，他莫昔芬组和低、中、高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠乳腺组织中腺泡形状规则，分泌物减少，细胞增生程度减轻；与他莫昔芬组比较，高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠乳腺组织中腺泡形状相对规则，分泌物减少，细胞增生程度减轻。见图1(插页四)。

表1 各组大鼠乳头高度和乳头直径

Tab.1 Heights and diameters of nipples of rats in various groups (n=10,±s,l/mm)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各组大鼠血清激素水平 与对照组比较，模型组大鼠血清中E2、LH、PRL和GnRH水平明显升高(P<0.05)，P水平明显降低(P<0.05)，而FSH 水平略升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，低、中和高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠血清中E2、LH、PRL和GnRH水平均明显降低(P<0.05)，同时P和FSH水平明显升高(P<0.05)，且呈现出一定的剂量依赖性；与他莫昔芬组比较，高剂量柴芍乳癖颗粒组各激素水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4 各组大鼠血清中VEGF和bFGF水平 与对照组比较，模型组大鼠血清中VEGF和bFGF 水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，低、中和高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠血清中VEGF和bFGF水平均明显降低(P<0.05)；与阳性药他莫昔芬组比较，中和高剂量柴芍乳癖颗粒组VEGF水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠血清中bFGF水平降低明显(P<0.05)。 见表3。

2.5 各组大鼠乳腺组织中VEGF和bFGF蛋白表达水平 光镜下观察：VEGF和bFGF蛋白在大鼠乳腺组织细胞胞浆中染色为黄色和棕黄色。与对照组比较，模型组大鼠乳腺组织内VEGF和bFGF蛋白表达水平升高(P<0.05)；与模型组比较，他莫昔芬组和中、高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠乳腺组织中VEGF和bFGF蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与他莫昔芬组比较，中和高剂量柴芍乳癖颗粒组大鼠乳腺组织中VEGF和bFGF蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图2(插页四)和图3(插页五)及表4。

表2 各组大鼠血清激素水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

表3 各组大鼠血清中VEGF和bFGF水平

Tab.3 Levels of VEGF and bFGF in serum of rats in various groups [n=10,±s,ρB/(ng·L-1)]

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

表4 各组大鼠乳腺组织中VEGF和bFGF蛋白表达水平

Tab.4 Expression levels of VEGF and bFGF proteins in breast tissue of rats in various groups (n=10,±s)

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group;#P<0.05 compared with tamaxifen group.

3 讨 论

乳腺增生发生多因内分泌紊乱，与体内激素失调有密切关联，尤其是雌、孕激素比例失衡。雌激素长期大量存在于乳腺组织，同时在不断循环的月经周期中，又缺乏孕激素的有效保护作用，导致乳腺小叶腺泡、导管过度增生，引发乳腺增生[3，8-9]。

西医认为乳腺增生与内分泌激素紊乱等有关，目前尚未有特效疗法。古今乳病多归责于肝和胃，乳腺增生属中医“乳癖”范畴。中医认为乳腺增生与气滞和精神因素有关，肝气郁结、冲任失调、痰凝血瘀是主要病机，气滞血不行，日久形成血瘀，久而久之形成结块[10]。柴芍乳癖颗粒由多味中药组成，方中柴胡、白芍及青皮疏肝理气止痛、养血敛阴、散结止痛；党参、白术、茯苓益气健脾、利水渗湿；郁金活血止痛、行气解郁；夏枯草消癖散结消肿，三七、当归活血补血，瓜蒌皮、浙贝母清热化痰、理气宽胸；王不留行活血通经；丹参活血祛瘀止痛；蒲公英和山慈菇清热解毒、化痰散结。诸药合用，共奏疏肝理气、活血化瘀、散结止痛、健脾益气之功。现代药理学研究[11]显示：当归与柴胡对肿瘤生长具有很好的抑制效果，蒲公英与山慈菇的被证实具有抗癌功效。

PRL是由垂体远侧部的嗜酸性细胞产生的一种泌乳素，研究[12]表明：PRL具有促进乳腺生长发育和维持泌乳的作用，对下丘脑-垂体-卵巢轴可产生一定的抑制效果。乳腺作为PRL的靶器官，含有丰富的PRL受体。当血中PRL异常升高时，会对黄体期P的分泌产生抑制作用，同时刺激E2的合成，导致E2/P比例失调，对乳腺组织产生不良刺激，引发乳腺组织的过度增生[13]。GnRH是由下丘脑合成的一种十肽激素，以脉冲分泌方式到达垂体前叶，刺激垂体细胞合成、分泌FSH和LH，而LH和FSH能够刺激E2和P的合成和分泌[14]。研究[15]显示：VEGF和bFGF水平与乳腺增生程度呈正相关关系。研究[16-18]表明：VEGF和bFGF可以促进乳腺增生血管生成，为增生细胞生长提供营养物质和氧气，并及时排泄代谢产物。靳亚慈[19]研究显示：乳腺组织和血清中VEGF和bFGF的增多会引发乳房组织微循环障碍，VEGF和bFGF被激活后通过共同途径促使乳腺增生病的发生。

本研究结果显示：柴芍乳癖颗粒可明显降低乳腺增生模型大鼠血清E2水平，升高血清P和FSH水平，调节血清E2/P比值，同时降低血清LH、PRL、GnRH、VEGF和bFGF水平，改善乳腺增生模型大鼠的内分泌激素紊乱，结合乳腺组织免疫组织化学结果，表明柴芍乳癖颗粒可明显降低大鼠乳腺增生组织中VEGF和bFGF蛋白表达水平，这可能是其发挥抑制和减缓乳腺增生发生发展的作用机制之一，本研究结果为紫芍乳癖颗粒在临床广泛应用提供了实验依据。