乳腺癌患者超声图像特征与人类上皮生长因子受体2和Ki-67阳性表达的关联性分析

郑 芳,欧阳征仁，欧阳靖霖，周诗力,罗 文

(1.南华大学附属第二医院超声科，湖南 衡阳 421001； 2.湖南环境生物职业技术学院内科学教研室，湖南 衡阳 421001)

乳腺彩色多普勒超声检查是乳腺癌早期发现、早期诊断的重要手段。研究[1]显示：多普勒超声检查在乳腺癌诊断中占据重要的地位。Ki-67为常见的核蛋白质，与细胞增殖有密切关联[1]。研究[2]提示：Ki-67与恶性肿瘤的转移和分化密切关联。人类上皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2) 也称为CerbB-2，属于原癌基因，与细胞生长和分化有关，与乳腺癌的恶性程度呈正相关关系。如何通过无创的影像学技术直接或间接反映乳腺癌的预后因子，探寻二者间的关联性，一直是国内外学者研究的热点声，然而将彩色超声与CerbB-2和Ki-67等指标联系的研究较少。本研究旨在通过超声检查分析乳腺癌影像学特征与CerbB-2和Ki-67表达的关系，为乳腺癌诊断、治疗及预后评估提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年11月—2016年11月在南华大学附属第二医院接受治疗的107例乳腺癌患者作为研究对象，患者年龄45～75岁，平均年龄(62.8±4.7)岁。按照病理分型：浸润性导管癌58例，黏液癌36例，浸润性小叶癌13例。根据国际TNM(2011)标准[4]进行划分临床分期：Ⅰ期乳腺癌患者59例，Ⅱ期乳腺癌患者35例，Ⅲ期乳腺癌患者13例。病例纳入标准：①患者经临床病理诊断确诊为乳腺癌；②均符合国际乳腺癌TNM(2011)标准；③均不伴有其他乳腺疾病；④患者及家属均同意参与本次研究，并签署知情同意书。病例排除标准：①并发肿瘤远处转移或自身患有其他恶性肿瘤者；②伴有其他乳腺疾病(如乳腺囊肿和乳腺炎等)者；③伴有神经系统疾病及行为失常者。

1.2 试剂和主要仪器 CerbB-2试剂盒和Ki-67试剂盒(福州迈新生物技术公司)。彩色多普勒超声检测仪(GE LOGIQ E9，美国通用电气公司)。

1.3 常规超声检测 应用彩色多普勒超声检测仪，将探头的频率设置为7.5 MHz，患者取仰卧位，暴露患者乳腺，采用直接探测法在患者乳房象限行扇形检查，发现病灶部位时，记录乳腺肿块的边界、形状、纵横比、内部回声、后放回声、钙化及血流的情况。肿块的血流信号参照Adler 半定量分级法：0级，无明显血流；1级，小于2处的点状血流；2级，发现1条血管或3～4处点状血流；3级，发现大于1条的血管或4处以上的点状血流。

1.4 免疫组织化学法检测Ki-67和CerbB-2的表达 术中或穿刺活检取乳腺癌组织，严格按照试剂盒的说明操作进行检测，制作5 μm的石蜡切片，采用脱蜡、酒精水化以及水冲洗2次，之后行3次PBS液冲洗，每次3 min，行振荡处理。pH6.0的枸橼酸盐内煮沸15 min，加入H2O2孵育10 min后用PBS液冲洗3次，每次3 min。加入50 μL一抗溶液，孵育60 min后，用PBS液冲洗3次，每次3 min；除去PBS溶液，加入100 μL DBS溶液，5 min后冲洗、苏木素染色，之后行PBS冲洗、乙醇脱水以及二甲苯溶液过滤封片。CerbB-2和Ki-67免疫染色阳性判定[5]：CerbB-2检测以细胞膜上出现黄色或棕黄色为阳性，Ki-67检测在细胞浆内出现黄色或棕黄色为阳性。采用400倍显微镜观察切片，在每个切片中观察10个视野，每个视野计数100个细胞，记录阳性细胞百分率，以组织中阳性细胞数比值将其分为阴性和阳性，阴性：阳性细胞数 0%～10%；阳性：阳性细胞数>10%。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。超声征象特征及Ki-67和CerbB-2在乳腺癌组织中的阳性表达率以百分率(%)表示，采用Spearman相关分析评估乳腺癌Ki-67和CerbB-2表达的关联性。采用χ2检验比较不同乳腺癌超声图像特征患者Ki-67、CerbB-2表达的差异，采用Cox比例风险回归模型进行乳腺癌患者5年生存结局的多因素生存分析。分析乳腺癌患者超声特征与Ki-67和CerbB-2表达的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌超声图像特征 107例乳腺癌患者中，病灶直径为 0.8～9.8 cm，病灶直径>2 cm者67例(62.6%)，形态不规则者54例(50.5%)，边界不清晰者55例(51.4%)，肿瘤纵横比>1者43例(40.2%)，内部回声不均匀者67例(62.6%)，肿瘤的后方回声衰减32例 (29.9%)，肿块中发现细小钙化者33例(30.8%)，CDFI 显示血流分级 2～3 级者52例(48.6%)。乳腺癌超声图像显示：形态不规则，边界不清晰，后方回声衰减，2～3级血流。见图1(插页六)。

2.2 Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白在乳腺癌组织中的表达 107例乳腺癌组织中Ki-67蛋白阳性表达率为81.21%(87/107)，CerB-2蛋白阳性表达率为73.83%(79/107)。Spearman相关性分析结果显示：Ki-67与CerbB-2表达呈正相关关系(r=0.264，P=0.001)。见图 2(插页六)。

2.3 Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白的表达与超声图像特征的关系 肿瘤纵横比>1、内部回声不均匀、后方回声衰减、肿块内微小钙化、血流分级 2～3级与乳腺癌组织中Ki-67蛋白表达有关(P<0.05)，而边界、直径、形状与Ki-67蛋白表达无关(P>0.05)；乳腺癌边界、直径、形状、肿瘤纵横比>1、内部回声不均匀、后方回声衰减、肿块内微小钙化、血流分级 2～3 级与乳腺癌组织中CerbB-2蛋白表达有关(P<0.05)。见表1和2。

2.4 影响乳腺癌患者预后多因素Cox模型回归分析 多因素Cox模型回归分析结果显示：影响乳腺癌患者5年生存结局的独立因素包括CerbB-2蛋白()表达(P=0.002)、Ki-67蛋白()表达(P=0.006)、血流分级 2～3 级(P=0.036)、后方回声衰减(P=0.001)和肿瘤纵横比>1(P=0.002)。见表3。

3 讨 论

彩色多普勒超声是乳腺癌诊断的重要辅助检查之一，近年来，其在乳腺癌患者术前诊断中应用越来越广泛，可提高乳腺癌临床检出率。研究[6-7]显示：常规彩色多普勒血流成像(color doppler flow ima-ging, CDFI)易受检测部位、肿瘤组织深浅和血流速度等影响，对相对细小血管分支及低速血流信号难以检测。乳腺癌的超声表现为低回声，边缘毛刺、角状边缘、前后径大于横径、肿块后方回声衰减、点状钙化和高回声晕[8]。本研究中，107例乳腺癌患者中，病灶直径>2 cm者占62.6%，形态不规则者占50.5%，边界不清晰者占51.4%，肿瘤纵横比>1者占40.2%，内部回声不均匀者占62.6%，肿瘤的后方回声衰减占29.9%，肿块中发现细小钙化者占30.8%，血流分级 2～3 级者占48.6%，该结果与其他研究结果基本一致[9-10]。

研究[21]表明：Ki-67与细胞内的逆转录密切关系，在细胞分裂增殖期活跃。关于肿瘤的形态与生

表1 乳腺癌组织中Ki-67表达与超声图像特征的关系

续表1

Ultrasound featuren Ki-67 expression+-χ2PInternal calcification Yes No337422(66.67)23(31.08)11(33.33)51(68.92)13.022<0.01Blood flow grade 0 1 2 3282725273(29.63)8(29.63)15(0.60)19(70.37)25(70.37)19(70.37)10(9.40)8(29.63)9.2540.007

表2 乳腺癌组织中CerbB-2表达与超声图像特征的关系

表3 多因素回归COX模型分析乳腺癌患者预后独立影响因素

χ2=47.20，ν=5，P<0.001.

物学标记物之间的关系，各研究报道结果相异，肿瘤形态不规则及其肿瘤纵横比>1 提示肿瘤细胞向肿瘤周围转移速度不一样[22-23]。本研究中，肿瘤的纵横比与Ki-67蛋白及 CerbB-2蛋白有关联，其主要原因可能是其均在细胞增殖和分化过程中发挥作用。乳腺癌边缘毛刺征及周边高回声晕是其特征性指标，本研究结果显示：边缘有毛刺征者Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白的阳性表达率均高于无此征象者，说明 Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白阳性表达者肿瘤细胞分化差，恶性度高，具有更高的侵袭性行为。乳腺癌的钙化是组织细胞变性、坏死和钙盐沉着造成的。本研究中，微小钙化者Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白的阳性表达率均高于无此征象者，提示存在微钙化的肿瘤的侵袭性强，预后不良。

本研究存在一定的缺陷，如未进行随访，未进行生存分析；本研究中样本量不足，数据的统计学意义可能不充分。

综上所述， 乳腺癌的超声声像图表现与Ki-67蛋白和CerbB-2蛋白表达等有密切关联，通过对乳腺癌声像图特征的分析，可为乳腺癌的生物学行为及临床预处理和判断患者预后等提供依据。