茶皂素对PRRSV感染Marc-145细胞受体表达及Caspase-9活化的影响

侯震，董蒨蒨，黄剑钢，尹伟，范阔海，孙耀贵，李宏全

(山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是猪的一种病毒性急性传染病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)所引起的[1]。目前，PRRS已经严重影响了全世界的养猪业，给养猪业造成了巨大的经济损失[2]。目前，主要通过接种疫苗来防治本病，但随着不同毒株的出现，对PRRS的防控难度日益增加。天然产物在药物研发过程中起着相当重要的作用，市面上的大多数药物都是直接或间接源自于天然产物。研究前期筛选出了多种具有抗病毒作用的天然化合物，例如苦参碱能够抑制PRRSV[3]和PCV2[4]在细胞上的复制；丹参酮IIA磺酸钠可以干扰PRRSV[5]和MDV[6-7]的增殖。

茶皂素是前期体外筛选抗PRRSV天然化合物时，筛选出来的一种从茶树种子中提取出来的一类糖苷化合物。实验室前期结果已经证实了茶皂素的体外抗PRRSV作用，并已证实茶皂素能显著抑制PRRSV N蛋白的表达，从而影响病毒在细胞内的复制[8]。但茶皂素的抗PRRSV作用是否只局限在直接作用于病毒尚未报到。文献报道清道夫受体CD163[9]和波形蛋白(Vimentin)[10]是PRRSV穿入Marc-145细胞的重要受体[11]。细胞受体可能是茶皂素抗病毒作用的靶点之一。此外，PRRSV可以通过内源性线粒体通路引起细胞凋亡，凋亡亦可作为研究抗病毒机制方向之一[12]。

前期的细胞毒性试验和抗病毒试验，已经证实茶皂素在Marc-145细胞上的最大安全浓度(maximum no-cytotoxic concentration，MNTC)为30 μg/mL，且在该浓度下，TS对PRRSV的复制有抑制作用[8]。因此，试验在此浓度下，从PRRSV感染细胞的受体入手，在mRNA和蛋白水平研究TS对感染PRRSV的Marc-145细胞上CD163和Vimentin两种受体的表达量影响，并在蛋白水平上初步研究TS对感染PRRSV的Marc-145细胞中caspase-9活化的影响，以补充TS抗PRRSV的机制，为茶皂素的后续开发提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂 细胞级DMSO及DMEM高糖液体培养基购于美国Sigma公司；β-actin单克隆抗体、高灵敏度化学发光检测试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；caspase-9抗体购于美国Cell Signaling Technology 公司；FITC标记山羊抗鼠IgG购于北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体购于北京全式金生物技术有限公司；脱脂奶粉、兔抗CD163抗体购于武汉博士德生物工程有限公司；Vimentin多克隆抗体购于南京巴傲德生物科技有限公司；SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ及PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser购于大连TaKaRa公司；蛋白提取试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司。

1.2 药品 试验所用药物TS浓度为98%，由北京中医药大学中药学院雷海民教授惠赠。阳性药物利巴韦林标准品(批号：140629-200202)购于中国食品药品检定研究所。

1.3 细胞、病毒 Marc-145细胞购买于中国兽医药品监察所。高致病性JXAJ-R株PRRSV活疫苗，购于广东大华农动物保健品股份有限公司，其生产批号为1012001，毒力为10-6。

1.4 TS对CD163、Vimentin基因作用的测定

1.4.1 细胞总RNA的提取与反转录 根据文献[13]进行样品制备，分别设细胞对照组、病毒对照组(100TCID50)、30 μg/mL TS试验组、0.125 mg/mL利巴韦林对照组。在6孔板中，接种Marc-145细胞，待细胞长至80%左右，与PRRSV(100TCID50)在4 ℃下共孵育2 h，弃掉病毒液。然后加入2% DMEM细胞生长维持液，放入37 ℃培养箱中(从此时开始计时，即为穿入0 h)，2 h将2%DMEM细胞生长维持液用药液替换，并继续放入37 ℃培养箱中，到穿入5 h时，将TS试验组和利巴韦林对照组培养液换为2%DMEM细胞生长维持液，仍放入37 ℃培养箱中继续孵育24 h。使用TRIzol®Reagent试剂盒，进行RNA样品的提取。根据TaKaRa反转录试剂盒说明进行cDNA合成，普通PCR扩增。

1.4.2 qRT-PCR反应检测CD163和Vimentin mRNA基因的表达量 根据NCBI数据库中猴属CD163、Vimentin和18S基因核酸CDS区序列，运用Primer3 Plus软件设计出以下3对引物见表1，由华大基因公司合成。

表1 引物序列及PCR产物大小Tab 1 Primer sequences and the size of PCR products

以cDNA为模板，加入各检测基因的对应引物，进行SYBP Green RT-PCR反应，反应条件依次为：90 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，退火温度56 ℃，退火30 s，整个过程设40个循环数。以18sRNA作为内参，所得数据采用2-△△Ct法对目的基因的表达量进行比较分析。

1.5 TS对CD163和Vimentin蛋白作用的测定 根据1.4.1项样品，使用蛋白提取试剂盒提取蛋白。使用NanoDrop核酸蛋白分析仪进行蛋白浓度测定。分别以兔抗CD163单克隆抗体、兔抗Vimentin(I444)单克隆抗体和鼠抗β-actin单克隆抗体为一抗，山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶10000)或山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)为二抗进行Western blot检测。

1.6 TS对caspase-9蛋白活化作用的测定 设细胞对照组，病毒对照组(100TCID50)，TS对照组，30 μg/mL TS加毒试验组(先加100TCID50PRRSV 6 h，用PBS洗2遍，再加TS)，利巴韦林125 μg/mL加毒对照组，30 μg/mL TS加毒试验组(先加100TCID50PRRSV 12 h，用PBS洗2遍，再加TS)，在24 h后使用蛋白提取试剂盒提取蛋白，收集caspase-9蛋白样品。使用NanoDrop核酸蛋白分析仪进行蛋白浓度测定。分别以兔抗caspase-9单克隆抗体和鼠抗β-actin单克隆抗体为一抗，山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1∶10000)或山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)为二抗进行Western blot检测。

1.7 数据分析 本试验均通过(GraphPad Software，Inc.California，USA)软件计算处理而得到所有相关数据以及方差分析，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有实验均经过3次独立重复试验，且每次试验设有4个重复。

2 结果与分析

2.1 TS对CD163和Vimentin基因表达量的测定

如图1所示，与细胞对照组相比，病毒组CD163和Vimentin基因表达量差异不显著(P>0.05)；TS试验组及利巴韦林对照组CD163和Vimentin基因表达量显著降低(P<0.05)。与病毒组相比，TS试验组CD163和Vimentin基因表达量显著降低(P<0.05)；利巴韦林对照组CD163基因表达量显著降低(P<0.05)，而Vimentin基因表达量差异不显著(P>0.05)；与利巴韦林对照组相比，TS试验组CD163、Vimentin基因表达量差异不显著(P>0.05)。

相同字母表示组与组之间差异不显著(P>0.05)，不同字母表示组与组间差异显著(P<0.05)The same letters indicate no significant differences between groups(P>0.05), different letters show significant differences between groups(P<0.05)图1 CD163和Vimentin各组基因的表达量Fig 1 The mRNA expression of CD163 and Vimentinin in each group

2.2 TS对CD163 和Vimentin 蛋白合成的影响 以β-actin作为内参蛋白，采用Image Pro Plus软件对各组蛋白条带灰度值进行定量分析。结果如图2所示，TS试验组CD163、Vimentin蛋白表达量均显著少于细胞对照组和病毒对照组(P<0.05)，细胞对照组与病毒对照组两种蛋白的表达量差异不显著(P>0.05)，利巴韦林对照组两种蛋白的表达量高于TS试验组，但差异不显著(P>0.05)。

相同字母表示组与组之间差异不显著(P>0.05)，不同字母表示组与组之间差异显著(P<0.05)The same letters indicate no significant differences between groups(P>0.05), different letters show significant differences between groups(P<0.05)图2 CD163和Vimentin各组蛋白的表达量Fig 2 The expression of CD163 and Vimentinin in each group

2.3 TS对caspase-9蛋白活化的影响 本试验采用western blot对各组caspase-9的表达情况进行检测，以β-actin作为内参蛋白，结果如图3所示。正常细胞对照组、病毒对照组、TS对照组以及利巴韦林对照组在细胞培养24 h时，均不出现caspase-9的活化；先加毒6 h和12 h再加TS的两个试验组均能检测到明显的caspase-9活化片段；六个组均能检测到以酶原形式存在的caspase-9。

图3 24h caspase-9蛋白的表达Fig 3 The expression of caspase-9 protein at 24h

3 讨论与结论

3.1 TS对细胞受体CD163和Vimentin的基因合成和蛋白表达的影响 PRRSV进入Marc-145细胞过程中CD163和Vimentin具有重要作用[13]。据研究报道证实，细胞受体CD163在PRRSV侵入与复制的过程中起着一定作用[2,14-15]。Kim等[10]于2006年报道证实Marc-145细胞受体Vimentin可以与PRRSV中的N蛋白相互作用介导病毒侵入。目前，常见的抑制PRRSV增殖的报道都是以细胞受体PCBP1和PCBP2为靶点进行抗PRRSV研究[16-17]，TS能否抑制感染PRRSV细胞的CD163和Vimentin表达，可以作为研究其抗病毒活性的途径之一。试验选择以CD163和Vimentin两种Marc-145细胞受体为靶点进行抗PRRSV侵入机制的研究。从qRT-PCR与Western blot结果来看，TS可显著抑制感染PRRSV的Marc-145细胞受体CD163和Vimentin mRNA和蛋白水平的表达。推测TS可通过抑制PRRSV入侵细胞的过程来发挥其抗PRRSV作用。

3.2 TS对细胞内源性凋亡通路启动子caspase-9活化的影响 药物能够通过促进病毒感染早期宿主细胞的凋亡或者抑制病毒感染晚期细胞的凋亡，是凋亡的一种抗病毒机制[18]。然而，目前针对抗PRRSV凋亡机制的研究并未有报道。中药抗病毒凋亡通路机制可以选用caspase-8、caspase-9、caspase-3的活化作为检测指标[19-21]。在本实验室课题组前期的研究中，已证实在PRRSV感染Marc-145细胞24 h时检测不到活化的caspase-3，而在第48 h和60 h均能检测到活化的caspase-3片段[10]，因此推测病毒感染细胞24 h可能是感染细胞发生凋亡的早期阶段。Roy等[22]于2000年研究发现，PRRSV能够激活依赖caspase-9的细胞内源性凋亡途径，即当细胞受到死亡受体信号刺激时，通过一系列的信号传导途径，激活caspase-9，最终导致宿主细胞的凋亡。同样，Sang-Myeong Lee[19]等于2007年研究证实，PRRSV体外感染Marc-145细胞，能够引起细胞内源性凋亡信号通路的关键因子细胞色素C从线粒体内释放到细胞质，使得Bax的表达上升。因而试验选择caspase-9为靶点，进行TS作用于PRRSV感染Marc-145细胞早期时caspase-9是否能够活化的研究。Western blot 结果显示，在PRRSV感染宿主细胞24 h时，细胞自身、病毒感染的细胞、阳性药物利巴韦林与病毒作用的细胞caspase-9均不出现活化，而在TS作用于病毒感染细胞的两个试验组中，TS明显促进了内源性凋亡信号caspase-9的活化，从而使细胞启动不可逆的凋亡过程。该结果表明，当病毒完全侵入宿主细胞，在进入复制阶段，加入TS出现了细胞凋亡现象，表明TS有可能在病毒复制早期通过内源性信号途径促进细胞凋亡，从而起到了抗病毒作用，这为TS抗病毒机制研究提供了一条新的思路。TS可通过抑制CD163和Vimentin的表达，进而抑制PRRSV在Marc-145细胞上的侵入过程，从而达到抗PRRSV的作用；亦可通过激活细胞凋亡内源性通路以早期促进细胞凋亡的方式，进而抑制PRRSV的复制，发挥其抗PRRSV的作用。