阿维菌素残留溶剂气相色谱检测方法的建立

韩宁宁，于晓辉，戴青，于丽娜，赵晖，杨秀玉

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

阿维菌素(avermectin)是1975年从阿维链霉菌中分离得到的十六元环大环内酯类聚酮化合物，因其高效、低毒的杀虫活性而被广泛应用在农业、畜牧业和医药行业上[1]。目前，我国是阿维菌素唯一生产国[2]，获原料药生产批准文号的企业达16个。但由于其稳定性欠佳，一直未收录至《中国兽药典》，目前其标准收载于农业部公告第1960号中，该标准对阿维菌素残留溶剂并未进行相应控制。其制备工艺的主要残留溶剂为甲醇，本研究拟采用气相色谱法建立阿维菌素残留溶剂检测方法，以完善其质量标准。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与设备 气相色谱仪：Agilent 7890A，配氢火焰离子化检测器(FID)；电子天平：METTLER AX205；离心机：Thermo Biofuge Stratos。

1.2 药品与试剂 甲醇来源/批号：Merck/1060074008；阿维菌素原料药来源：河北威远动物药业有限公司。

2 方 法

2.1 色谱条件 采用Agilent DB-624毛细管柱，柱编号125-1334/USA302214H，固定相：6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷，30 m×0.53 mm×3 μm。进样口温度220 ℃。检测器温度250 ℃。载气：氮气。流速5 mL/min。进样量0.2 μL。分流比：10∶1。程序升温：初始温度为50 ℃，保持5 min，以每分钟15 ℃的速率升温至80 ℃，再以每分钟26.7 ℃的速率升温至240 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备 取甲醇约0.15 g，精密称定，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取2 mL置离心管中，精密加水2 mL，精密加内标溶液(取异丙醇0.5 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度)1 mL，混匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品约0.12 g，精密称定，置离心管中，加间二甲苯2 mL使溶解。精密加水2 mL，混匀，离心。取出上层液再精密加水2 mL萃取一次。合并两次萃取的水层液，精密加内标溶液1 mL，离心去掉上层剩余间二甲苯，取水层作为供试品溶液。

2.2.3 回收率供试品溶液的制备 取供试品约0.24 g，精密称定，置离心管中，加间二甲苯4 mL使溶解。加甲醇约12 mg，精密称定，混匀。精密加水4 mL，混匀，离心。取出上层液再精密加水4 mL萃取一次。合并两次萃取的水层液，精密加内标溶液2 mL，离心去掉上层剩余间二甲苯，取水层作为回收率供试品溶液。

2.2.4 定量限溶液的制备 取甲醇约0.15 g，精密称定，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置200 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取2 mL置离心管中，精密加水2 mL，精密加内标溶液1 mL，混匀，作为定量限溶液。

2.2.5 线性溶液的制备 取甲醇适量，精密称定，用水稀释制成浓度分别为0.015、0.15、0.3、0.6、1.2、3、6 mg/mL的溶液，作为线性溶液。将上述线性溶液照对照品溶液“精密量取2 mL……”处理后进样。

3 结果与分析

3.1 专属性 对照品溶液色谱图(图1)中，甲醇峰与内标异丙醇峰的分离度为12.2，符合《中国兽药典》[3]2015年版一部附录残留溶剂测定法分离度应大于1.5的要求；理论塔板数按甲醇峰计为14410，亦符合主峰塔板数应不低于5000的要求。供试品溶液色谱图(图2)中，除甲醇峰、异丙醇峰外，还有萃取残存的间二甲苯峰，其与异丙醇的分离度为70.2，亦符合要求。

图1 对照品溶液色谱图Fig 1 The chromatography of the standard solution

图2 供试品溶液色谱图Fig 2 The chromatography of the sample solution

3.2 标准曲线及线性范围 以甲醇峰面积与异丙醇峰面积的比值为(y)为纵坐标，相应甲醇浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=1.3142x-0.0188，相关系数r=0.9999，表明甲醇在0.006～2.4 mg/mL的浓度范围内线性关系良好。

3.3 定量限 以甲醇峰信噪比S/N约为10的甲醇浓度作为定量限。此时甲醇浓度为6 μg/mL。

3.4 回收率 该方法甲醇的平均添加回收率为90.8%，RSD为1.4%。添加回收率损失了10%左右，表明两步萃取过程使甲醇产生了损失，但仍符合《中国兽药典》[3]兽药质量标准分析方法验证指导原则关于待测成分含量0.1%左右回收率限度为90%～108%的要求(表1)。

3.5 重复性 对上述阿维菌素原料药进行6次甲醇含量测定，结果平均为0.3%，RSD为3.0%，亦符合《中国兽药典》[3]兽药质量标准分析方法验证指导原则关于待测成分含量0.1%左右重复性限度为3%的要求(表2)。

3.6 耐用性 对该方法进行了柱温起始温度±5 ℃、流速±0.5 mL/min、进样口温度±10 ℃、检测器温度-10 ℃及更换不同内径的色谱柱等方面的耐用性进行了考察，结果参见表3。在上述各耐用性考察条件下，甲醇理论塔板数均符合《中国兽药典》[3]2015年版一部附录残留溶剂测定法应不低于5000的规定，甲醇与异丙醇的分离度均符合大于1.5的规定。

表1 甲醇添加回收率测定结果Tab 1 The results of the recovery rate of added methanol

表2 甲醇含量重复性测定结果Tab 2 The results of the repeatability of methanol content

表3 方法耐用性结果Tab 3 The results of method durability

4 讨论与结论

4.1 色谱柱的选择 由于伊维菌素是阿维菌素的衍生物，二者在溶解性质等方面具有相似性，故本方法在建立过程中参考了《中国兽药典》[3]一部伊维菌素残留溶剂检查方法。上述方法测定目标物为乙醇与甲酰胺，采用的色谱柱为聚乙二醇(PEG-20M)毛细管柱。在建立阿维菌素中甲醇残留溶剂的检查方法过程中，考虑聚乙二醇为强极性色谱柱填料，同为强极性的甲醇在该柱上保留欠佳，峰形拖尾严重，故将聚乙二醇毛细管柱更换为中等极性的DB-624毛细管柱，以增加保留与改善峰形。

4.2 检测器温度的选择 上述方法检测器温度为280 ℃。而本方法将色谱柱更换为DB-624柱后，该色谱柱的最大耐受温度为260 ℃，故将检测器温度降低为250 ℃，以避免对色谱柱填料产生不可逆的损坏。

本试验所建立的阿维菌素残留溶剂气相色谱检查方法简单易行，耐用性良好，可用于阿维菌素原料中甲醇残留溶剂的测定，弥补了原质量标准中该项的空白。