大鼠深Ⅱ度烫伤合并创面感染模型的构建

郇 科，白 博，白晓智，苏 菲，陈 潇，桑宏勋,3

(1 空军军医大学西京医院，陕西 西安 710032； 2 陕西省第四人民医院，陕西 西安 710043； 3 南方医科大学深圳医院，广东 深圳 518101)

目前，烫伤已成为日常生产及生活中最常见的意外损伤之一。据统计，我国每年每百万人口中约有5 000～10 000人遭受烫伤[1-2]。创面感染是烫伤后最常见、最严重的并发症，引起创面感染的细菌主要为革兰阴性杆菌，其中铜绿假单胞菌是最常见的致病菌之一[3]。烫伤后创面感染如得不到及时救治，可能会引起严重后果，给患者带来沉重的精神和经济负担，患者的病死率明显升高[4-5]。动物烫伤感染模型的成功构建在创面修复方面的研究以及表面药物或敷料方面的研发中发挥着重要作用，因此，建立一种简单易行、稳定性高、重复性好的烫伤感染模型具有重要意义[6-7]。本实验应用自制烫伤仪对大鼠进行蒸汽烫伤，构建大鼠烫伤模型，排除重力、压力等因素的影响，在烫伤温度一致的情况下，烫伤时间成为控制烫伤深度的唯一因素。创面感染的病原菌选择临床上最常见的铜绿假单胞菌，其毒力稳定，易于培养分离，是制作创面感染的理想细菌。目前，对创面感染所需接种细菌浓度及接种方法方面的实验研究较少，本实验选择将3种不同浓度的细菌接种于烫伤创面，比较不同浓度的细菌感染大鼠深Ⅱ度创面愈合过程中不同时间痂面下细菌含量、愈合时间长短，从而选择出细菌感染最佳浓度，同时比较两种细菌接种方法的优缺点。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 雄性清洁级SD大鼠90只，体重186～253 g，由空军军医大学实验动物中心提供；铜绿假单胞菌ATCC 27853由空军军医大学西京医院检验科提供；戊巴比妥钠购自美国Sigma公司，异氟烷购自河北九派制药有限公司，SP-CT/218T型蒸汽挂烫机购自上海旭博公司，旋转切片机购自德国LEICA公司，CX31显微镜及摄像系统购自日本Olympus公司。

1.2 烫伤模型制备及最佳致伤时间分析

1.2.1 烫伤模型制备 拔掉SP-CT/218T型蒸汽挂烫机喷头，将容积50 mL、开口直径3 cm的耐热塑料管与导气管对接并固定组成喷头，在厚度2.5 cm耐热塑料板上做一个直径3.0 cm的圆形模具开口。选取40只SD大鼠，随机分成5组，每组8只。实验前1天给予10 g/L戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉(40 mg/kg)，麻醉后采用动物专用电剃刀剃去大鼠背部长毛，并给予80 g/L硫化钠进行脱毛。大鼠脱毛2 h后将挂烫机预热1 min，待蒸汽温度94 ℃，助手将直径3 cm模具置于大鼠背部待烫部位并固定，挂烫机喷头垂直置于模具上方进行烫伤并计时，各组大鼠致伤时间点分别为4、6、8、10、12 s，每只大鼠脊柱两侧分别致伤2个相同创面，致伤后创面未予任何处理，且立即给予大鼠腹腔注射5 mL生理盐水抗休克，然后将大鼠回笼后分笼饲养。

1.2.2 最佳致伤时间分析 致伤24 h后观察大鼠一般情况，每组选取6只烫伤大鼠处死，取1.5 cm ×0.5 cm大鼠创面全层皮肤样本，采用甲醛固定24 h后进行切片，切片组织进行HE染色，根据相关文献[8]判定烫伤深度。大鼠烫伤12 h后，烫伤时间4 s时大鼠创面皮肤表皮浅层受损，可见基底细胞层；烫伤时间6 s时大鼠创面皮肤表皮浅层坏死，部分真皮受损；烫伤时间8 s时大鼠皮肤表皮深层及真皮深层受损；烫伤时间10 s和12 s时大鼠创面皮肤全层及皮下组织皮肤附件完全受损。大鼠烫伤12 h后创面损伤逐渐发展，各组大鼠烫伤后不同时间点创面病理结果存在差异。大鼠烫伤24 h后，烫伤时间4 s大鼠创面皮肤表皮浅层受损，符合Ⅰ度烫伤标准；烫伤时间6 s大鼠创面表皮坏死脱落，部分细胞充血水肿，白细胞浸润，胶原纤维离散肿胀，符合浅Ⅱ度烫伤标准；烫伤时间8 s大鼠创面皮肤表皮细胞核固缩，真皮深层受损，胶原纤维融合，毛囊残留，符合深Ⅱ度烫伤标准；烫伤时间10 s和12 s大鼠创面皮肤全层及皮下组织皮肤附件完全受损，伤及肌肉层，符合Ⅲ度烫伤标准。见图1。烫伤时间8 s为深Ⅱ度烫伤创面最佳致伤时间，组织取材最佳时间为烫伤后24 h。

a：烫伤时间4 s，表皮浅层坏死；b：烫伤时间6 s，表皮深层受损；c：烫伤时间8 s，真皮浅层受损；d：烫伤时间10 s，真皮深层坏死

1.3 细菌菌悬液制备和创面感染模型构建

1.3.1 细菌菌悬液制备 将铜绿假单胞菌ATCC 27853复苏后接种于琼脂培养基上，37 ℃恒温培养18～20 h，用接种环挑取菌落接种于血培养基上，继续培养18～20 h，采用稀释法配制浓度为1×107、1×108和1×109CFU/mL的新鲜菌悬液。

1.3.2 创面感染模型构建 随机选取30只大鼠，按随机数字表法分为3组，每组10只，采用最佳致伤时间8 s构建深Ⅱ度烫伤创面模型。烫伤30 min待皮肤冷却后，烫伤大鼠创面切痂，3组大鼠一侧创面分别接种浓度为1×107、1×108和1×109CFU/mL的铜绿假单胞菌菌悬液0.3 mL，另一侧接种等体积生理盐水作为对照组，以无菌纱布覆盖创面，纱布边缘与正常皮肤缝合固定。

1.4 创面炎症反应、细菌定量及创面愈合时间 创面痂下接种细菌24 h后，观察创面状况，并取创面组织进行HE染色，采用显微镜观察创面炎症反应情况。每组10只大鼠分别于接种细菌后1 、2、4、7和14 d取创面中心少许组织，放入匀浆器中，加入2 mL生理盐水，电动搅拌器充分匀浆，然后将匀浆液按照1∶10比例稀释，然后取0.1 mL稀释液接种于琼脂平板，在37 ℃条件下孵育18～24 h后进行细菌计数。含菌量(CFU/g)=菌落数(CFU)×稀释倍数/组织重量(g)。创面愈合标准定义为创面完全上皮化，分别记录各组大鼠创面愈合时间。

1.5 创面细菌接种方法比较 选取20只大鼠按随机数字表法分为2组，每组10只，按照最佳致伤时间8 s制成深Ⅱ度烫伤创面模型，配制浓度1×109CFU/mL新鲜铜绿假单胞菌菌液。第1组(切痂涂抹法)大鼠创面切痂后立即接种1×109CFU/mL铜绿假单胞菌菌液0.3 mL，然后以无菌纱布覆盖创面并与边缘正常皮肤缝合固定；第2组(痂下埋藏法)大鼠创面不切痂，用小剪刀在创面痂边缘剪开一小口，然后将含1×109CFU/mL 0.3 mL铜绿假单胞菌菌液的小纱条塞入痂面下,以无菌纱布覆盖后与边缘正常皮肤缝合固定。参照1.4的方法和步骤计算含菌量、创面愈合时间。

2 结果

2.1 创面一般情况 烫伤开始至伤后24 h各组大鼠创面均呈圆形，直径约3.0 cm，烫伤8 s时创面与正常组织分界清楚，创面高出正常皮肤，随着致伤时间延长，创面潮湿、质感较硬、色泽渐暗、创面颜色由白色变为灰白。致伤时间8 s，大鼠伤后24 h创面质硬、无渗出、呈灰褐色，见图2。

图2 致伤时间8 s大鼠伤后24 h创面一般情况

Figure2General condition of wound 24 hours after 8-second injury in rats

2.2 不同浓度细菌感染创面时大鼠全身状况及创面组织学观察 3组大鼠一般精神状态可，进食好，眼部无分泌物。第1组感染菌量为1×107CFU/mL的大鼠创面分泌物较少有些甚至无分泌物，铜绿假单胞菌特有的恶臭味不明显，显微镜下可见少许炎性细胞浸润。第2组感染菌量为1×108CFU/mL的大鼠创面可见分泌物较多，并可闻及明显的恶臭味，显微镜下可见创面表皮及真皮浅层炎性细胞浸润明显。第3组感染菌量为1×109CFU/mL的大鼠创面可见大量分泌物，恶臭味明显，显微镜下可见弥漫性皮肤全层及肌层炎性细胞浸润，见图3、4。

2.3 创面痂下细菌定量结果 接种1×107CFU/mL细菌的大鼠创面细菌含量低于1×105CFU/g，第5天后细菌含量逐渐下降。接种1×108CFU/mL细菌的大鼠创面细菌含量高于1×105CFU/g，第7天后细菌含量逐渐下降。接种1×109CFU/mL细菌大鼠创面细菌含量高于1×105CFU/g，接种细菌后14 d 内细菌含量高于1×105CFU/g，并呈明显持续上升趋势。见表1。

a：接种菌量为1×107CFU/mL的大鼠创面未见明显炎性细胞浸润；b:接种菌量为1×108CFU/mL的大鼠创面可见表皮及真皮浅层炎性细胞浸润；c:接种菌量为1×109CFU/mL的大鼠创面可见皮肤全层及肌层弥漫性炎性细胞浸润

图3深Ⅱ度烫伤大鼠创面接种不同浓度铜绿假单胞菌后组织学表现(HE×200)

Figure3Histological observation of wound of rats with deep second-degree scald after inoculated with different concentrations ofP.aeruginosa(HE×200)

a:接种1×107CFU/mL细菌的大鼠创面基本红润，有少量分泌物；b:接种1×108CFU/mL细菌的大鼠创面可见的脓性分泌物；c:接种1×109CFU/mL细菌的大鼠创面可见大量脓性分泌物

图4深Ⅱ度烫伤大鼠创面接种不同浓度铜绿假单胞菌后外观表现

Figure4Appearance of wound of rats with deep second-degree scald after inoculated with different concentrations ofP.aeruginosa

表13组大鼠创面接种不同浓度铜绿假单胞菌后各时间点痂下细菌含量(×105CFU/g)

Table1Subeschar bacterial count of 3 groups of rats at different time points after inoculated different concentrations ofP.aeruginosa(×105CFU/g)

组别1 d2 d4 d7 d14 d接种1×109 CFU/mL细菌组(n=10)2.60±0.994.60±0.427.10±0.5627.02±1.8738.10±3.39接种1×108 CFU/mL细菌组(n=10)1.20±0.552.40±0.643.74±1.125.14±1.402.71±0.79接种1×107 CFU/mL细菌组(n=10)0.35±0.111.20±0.461.70±0.710.71±0.320.56±0.11

2.4 创面愈合时间比较 接种1×109CFU/mL铜绿假单胞菌的大鼠创面愈合时间为(21.4±2.4)d，长于对照组的创面愈合时间(18.4±1.7)d(t=2.72，P<0.05)。接种1×108CFU/mL铜绿假单胞菌的大鼠创面愈合时间为(19.4±1.1)d，接种1×107CFU/mL铜绿假单胞菌的大鼠创面愈合时间为(18.3±1.3)d，与对照组比较，差异均无统计学意义(t值分别为1.33、0.16，均P>0.05)。

2.5 两种接种方法比较 两种方法分别接种1×109CFU/mL细菌后14 d，大鼠创面痂下细菌含量均高于1×105CFU/g，呈持续上升趋势。见表2。痂下埋藏法愈合时间(22.5±1.5)d，切痂涂抹法愈合时间为(21.8±1.3)d，两种接种方法愈合时间比较，差异无统计学意义(t=1，P>0.05)。

表2两种方法接种1×109CFU/mL铜绿假单胞菌后各时间点大鼠创面痂下细菌含量(×105CFU/g)

Table2Subeschar bacterial count of rats at different time points after inoculated 1×109CFU/mLP.aeruginosaby two methods(×105CFU/g)

组别1 d2 d4 d7 d14 d痂下埋藏法(n=10)2.89±0.144.72±0.527.97±0.4528.27±0.8738.61±1.80切痂涂抹法(n=10)2.32±0.044.27±0.596.73±0.6726.73±0.6836.73±1.38

3 讨论

为客观的评价疗效，动物烫伤合并创面感染模型的构建在烫伤药物及敷料的研究中扮演着举足轻重的角色，因此，建立一种简便规范、可控制、重复性强，且与临床接近的动物模型，对烫伤合并创面感染的治疗和药物研究具有重要意义。

目前，国内外关于烫伤合并感染创面模型的研究较多[9-10]，其中Ⅰ度和浅Ⅱ度烫伤的创伤程度较轻，仅伤及表皮和真皮层，创面感染可以被自身清除，以自然愈合为主，创面的愈合过程和愈合时间接近；Ⅲ度烫伤由于创伤严重，容易造成侵袭性伤害，治疗周期长，病死率高，不适合进行动物模型相关研究[11]。深Ⅱ度烫伤创伤程度适中，创伤达真皮乳头层，损伤部分为网状层及皮肤附件结构，愈合周期在3周左右，能比较出各种治疗措施的疗效，是比较理想的烫伤动物模型[12]。

近年来，制作动物烧烫伤模型常用方法包括溴钨灯光辐射及闪光粉致动物体表烧伤、凝固汽油燃烧或开水烫伤致动物体表烧伤法、磷烧伤及高温金属模具烧伤等[13-14]。烫伤对皮肤的损害程度主要与致伤温度、时间、面积等因素相关，但以上方法不同程度上存在模型烫伤创面深度不一致、创面面积难以控制、致伤温度不恒定、操作过程繁琐等缺点，导致可重复性和实验效果均较差[15]。通过综合各种方法的优点，本研究应用的恒温蒸汽烫伤仪可在温度、时间和面积等方面达到标准化，提高动物模型构建的稳定性和可重复性。与传统模型相比，本研究建立的动物烫伤模型皮肤损伤仅由热力所致，排除了重力等因素的影响，在烫伤温度一致的情况下，烫伤时间成为控制烫伤深度的关键因素[16]。恒温蒸汽烫伤仪具有烫伤面积可控、深度均匀、创面干净、操作简单等优点，适合进行各种创面药物及敷料的比较及作用机制研究。

本实验组织病理观察可见烫伤深度随着致伤时间的延长逐渐加深。烫伤12 h时损伤处于进展阶段；烫伤24 h时创面深度稳定，同一致伤时间的病理结果一致；烫伤48 h时创面病理结果与伤后 24 h 比较无明显差异。烫伤对皮肤组织的损伤是动态变化的过程，因此，判定烫伤深度应以伤后 24 h后的结果为准，其中组织学病理观察被认为是确定烫伤深度的金标准[17]。烫伤合并创面感染后，机体免疫细胞启动炎症反应，产生大量炎症细胞并聚集[18]。

细菌负荷是影响创面感染的一个重要因素，当细菌负荷大于宿主的免疫防御能力时出现感染症状[19]。Krizek等[20]研究证实，当感染细菌负荷水平<105CFU/g，伤口愈合时间才开始逐渐延长。本实验结果显示，细菌负荷高于1×105CFU/g，愈合时间明显延长，被认为是有效感染的鉴定标准。本组实验结果显示，烫伤后创面接种细菌浓度不同创面感染程度不同，动物全身炎症反应也不同。当接种细菌浓度为1×108CFU/mL和1×107CFU/mL时，接种后4 d和7 d 细菌负荷开始减少，细菌大部分可以被机体清除，炎症反应不明显；与生理盐水对照组相比，炎性细胞浸润程度无明显差别，且合并感染的创面愈合时间和生理盐水对照组相近。当接种细菌浓度为1×109CFU/mL时，接种细菌后14 d内，痂下细菌含量呈持续上升趋势，且创面炎症反应明显，炎性细胞广泛浸润；与对照组相比，创面愈合时间延长。由此可以确定，接种细菌浓度1×109CFU/mL符合烫伤合并创面感染的发展进程，可以用来比较药物及敷料的疗效。

比较切痂涂抹法和痂下埋藏法两种接种方法，结果显示，两种方法形成的创面愈合时间相近，痂下埋藏法与自然的创面感染不同，局部易形成脓肿，感染灶不均匀，切痂涂抹法更接近临床感染，更适合进行烫伤合并感染的研究。

综上所述，本组研究结果提示，温度94℃、烫伤时间8 s、接种1×109CFU/mL浓度的铜绿假单胞菌为制作SD大鼠深Ⅱ度烫伤合并铜绿假单胞菌感染创面的最佳条件。由此条件构建的模型烫伤深度一致、重复性高、稳定性好，大鼠创面感染率高、病死率低，为烫伤患者创面治疗及修复机制的研究提供了实验室依据。但是，本研究仍存在一些不足，烫伤部位选取大鼠脊柱两侧皮肤，大鼠背部身体弧度使模具与皮肤接触不均匀，导致创面中间深、周围浅，应进一步对模具及其固定方法进行改善；大鼠背部创面的敷料采用胶布固定时，动物搔抓容易脱落，用环形胶布固定时包扎过紧使动物腹压增加，影响动物进食。采用创缘与纱布缝合固定，防止动物搔抓纱布敷料引起脱落，但缝合可以加重局部损伤，再加上大鼠个体差异及对感染的耐受程度不同等因素，均可以影响愈合过程及愈合时间。