响应曲面法优化鱼腥草多糖提取工艺及抗氧化活性测定

潘巧灵，姜 波*，于 静，冉乾鸿，李欢欢

（大连民族大学生命科学学院 116600）

近年来，中医药行业越发引起人们的关注，而壮药等民族医药更是因其特有的民族色彩而为人们所关注。鱼腥草，学名蕺菜，又名折耳根，多生长于广西等中国西南部地区，因其气味略带腥臭，故名鱼腥草。属胡椒目三白草科蕺菜属，常用的鱼腥草为蕺菜的地上干燥部分。性寒凉，归肺经，具有清热解毒、除湿利尿等作用，用于热毒、湿邪、疾热为患的肺痈等症。经研究表明，鱼腥草中含有黄酮类、甾醇类、生物碱、维生素、有机酸、水溶性多糖等多种物质，是极具开发潜力的植物资源[1-3]。但目前人们在生活中接触到鱼腥草的主要方式，还是采用直接食用或颗粒饮用等方式，鱼腥草成分提取的相关产品较少，本文旨在对鱼腥草水溶性粗多糖的提取工艺进行研究，以寻找最优提取方案，同时对多糖的抗氧化活性进行了测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼腥草（购买于广西南宁市药房，原产于广西），乙醇（95%），葡萄糖、苯酚、浓硫酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、番红花红、EDTA-Na2、硫酸亚铁、H2O2、抗坏血酸（Vc）、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、邻苯三酚、浓盐酸，以上试剂均为分析纯。

高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；电子分析天平，上海奥豪斯公司；仪表恒温水浴锅，金北德工贸有限公司；离心机，上海安亭科学仪器制造厂；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；循环式多用真空泵，郑州长城仪厂；超声清洗设备，大连开发区博信超声设备有限公司；UV2201型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鱼腥草多糖提取。将干燥鱼腥草用高速万能粉碎机粉碎，80目过筛，精确称取2.00g鱼腥草固体粉末，一定液料比加水浸泡，恒温水浴浸出，抽滤去渣取滤液，旋转蒸发浓缩滤液，加入5倍体积的95%乙醇，4℃冰箱静置24h，多糖沉淀，以4000r/min离心15min，并用无水乙醇洗涤，取沉淀蒸干得水溶性多糖，研磨待用[4]。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的测定。称取葡萄糖0.1g加入至100mL容量瓶并用蒸馏水定容，制得1.0mg/mL葡萄糖标准溶液。取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 配制好的葡萄糖标准溶液于100mL容量瓶中，去离子水定容，制得 10、20、30、40、50μg/mL 葡萄糖标准溶液。分别取上述配制的各浓度的葡萄糖溶液1mL于试管中，加入1mL 6%苯酚溶液，加入5mL浓硫酸，摇匀，静置30min，以蒸馏水做空白管，在488nm波长下测定标液的吸光值[5,6]。

1.2.3 鱼腥草多糖含量测定。分别取0.05g按步骤1.2.1所制得的鱼腥草水溶性粗多糖于50mL容量瓶中，去离子水定容，各取5mL配制的多糖溶液稀释至50mL容量瓶中，得到多糖稀释液。将所得的多糖稀释液同样以1.2.2中的苯酚——硫酸法测定其多糖含量，以蒸馏水代替糖溶液反应作为空白管。通过所测得的吸光度值与测定的葡萄糖标准曲线，可求得样品浓度，再通过以下两式计算可求出样品多糖含量与多糖得率[7]。

1.2.4 响应曲面设计。采用Box－Behnken试验方法对试验的提取温度、提取时间、料液比进行三因素三水平试验设计，试验条件见表1因素水平表。

表1 响应曲面因素水平表

1.2.5 鱼腥草多糖抗氧化活性测定。①对OH-清除率测定：利用Fenton体系，在每支试管分别加入1.5mL 0.15mol/L的磷酸缓冲溶液、0.2mL 260μg/mL番红花红溶液、0.7mL 2mmol/mL EDTA-Na2-Fe2溶液，再分别加入各级浓度多糖浓度试样1.0mL、0.8mL 3%H2O2溶液，混匀后37℃水浴保温30min，以蒸馏水做空白管，3%H2O2代替试样与EDTA-Na2-Fe2+溶液做对照管，在510nm波长下测定吸光度（A）。平行测定3次，取平均值，并与同浓度Vc清除率做对比。清除率计算公式为：清除率（%）=（A试样-A空白）/（A对照-A空白）×100。②对O2-清除率测定：取4.5mL 0.05mol/L pH-8.25的Tris-HCl缓冲液于试管中，于25℃水浴锅中预热25min，分别加入1mL不同浓度的多糖稀释液，0.4mL 3mmol/L邻苯三酚水溶液，以Tris-HCl为空白管，混匀于25℃精确反应4min，立即用0.5mL浓盐酸终止反应，在最大波长299nm下测吸光度。平行测定3次，取平均值，并与同浓度Vc清除率做对比。清除率计算公式为：清除率（%）=（1-A试样/A空白）×100。③对 DPPH清除率测定：2mL各级浓度多糖溶液分别加入2mL 0.16mmol/L的DPPH溶液，于25℃恒温反应15min，在波长525nm下测定吸光度[8]。平行测定3次，取平均值，并与同浓度Vc清除率做对比。清除率计算公式为：清除率（%）=（1-A试样/A空白）×100。

2 结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

在试验条件下，以葡萄糖浓度单位为横坐标、吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，求得葡萄糖标准曲线方程 为 y=0.0101x+0.0034，R2=0.9969，线性关系较好，结果如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 响应面试验结果

表2 响应面试验条件及结果

根据响应面法设计三因素三水平试验，对计算出的试验条件按步骤1.2.1进行多糖提取试验，求得相应条件下的多糖提取率，以Design expert8.0.6.1版软件对所得试验结果进行分析，所得结果见表2。

在试验结果的基础上以A（提取温度）、B（提取时间）、C（液料比）为自变量，Y（提取率）为响应值，求得多糖提取率对三因子的拟合回归方程为R1=5.18+0.15A-0.043B+0.22C-0.11AB+0.067AC-0.015 BC-0.45A^2-0.24B^2-0.52C^2，R2=0.9586。试验结果见表3。

表3 响应面分析结果

由表3可得知，该模型P值为0.0012，该模型差异极显著（p＜0.01）。R2=0.9586，说明有约95.86%的鱼腥草多糖提取率变化符合该模型，模型拟合程度较好，试验误差较小，该试验模型成立。由各因素F值可知，三因素对鱼腥草多糖提取的影响显著性排序为：C（液料比）＞A（提取温度）＞B（提取时间）[9]，A、B 与C 之间的交互作用不显著（P＞0.05），这表明鱼腥草多糖与各个因子之间不单单是线性关系；失拟项P=0.0634＞0.05表明失拟不显著，一定程度上说明模型拟合程度好，因此该模型可以对提取的多糖的ORAC值进行预测和分析。

由相关因素的3D响应面图及等高线图结合可看出，液料比对鱼腥草多糖提取工艺的影响极大，在适宜液料比下提取率较高，而当液料比过高时多糖提取率下降明显。AC之间的交互作用最显著，AB次之，BC之间交互作用最不显著。由软件求得的最佳实验结果为提取温度为81℃，提取时间为1.86h，料液比为32mL/g，提取率为5.22%，为验证试验准确性，按最佳试验结果重复进行3次试验，得到鱼腥草多糖提取率为5.07%，试验结果较好，该试验方案可行[10]。

图3 三因素对多糖得率影响的响应面图及等高线图

2.3 多糖抗氧化活性能力测定结果

2.3.1 对OH-清除率测定。通过在波长510nm下测定得到的吸光度及相关计算，得到鱼腥草多糖及同浓度Vc对羟基自由基的清除率。由图4可以看出，鱼腥草多糖对羟基自由基的清除率，与Vc清除能力对比较差，但随着多糖浓度的升高，其清除率也有着较为明显的提升。当多糖浓度达到10.15μg/mL时，对羟基自由基的清除率高达11.46%[11]。

图4 鱼腥草多糖及同浓度Vc对-OH清除率比较

2.3.2 对O2-清除率测定结果及Vc对比。通过在波长299nm下测定得到的吸光度及相关计算，得到鱼腥草多糖及同浓度Vc对O2-的清除率。由图5可看出，鱼腥草多糖溶液对O2-清除率对比同浓度Vc的清除率较低，且随着多糖浓度的增长，清除率提升幅度不大。

图5 鱼腥草多糖及同浓度Vc对O2-清除率比较

2.3.3 对DPPH清除率测定结果及Vc对比。通过在波长525nm下测定得到的吸光度及相关计算，得到鱼腥草多糖及同浓度Vc对DPPH的清除率。由图6可看出，鱼腥草多糖对DPPH的清除率，比同浓度Vc对DPPH清除率较低，但清除率强弱差距较小，且两者清除率曲线斜率相近，说明清除能力的线性关系相近，都随着浓度的增加而提升，说明鱼腥草多糖对DPPH的清除力较好。当多糖浓度达到10.15μg/mL时，对DPPH的清除率达到了66.31%。

图6 鱼腥草多糖及同浓度Vc对DPPH清除率比较

3 结论

通过响应面优化的方法对鱼腥草多糖提取工艺进行优化，对提取温度、提取时间、液料比进行试验，得出鱼腥草多糖提取的最优工艺参数为提取温度为81℃，提取时间为1.86h，料液比为32mL/g，鱼腥草多糖得率为5.22%，在此基础之上进行3次重复试验，得到平均提取率为5.07%，试验误差较小，说明试验方案可行性较高。通过测定鱼腥草多糖溶液对3种自由基离子的清除率，以及对同浓度Vc清除率的对比，对比两者抗氧化能力强弱。由清除率图表可知，鱼腥草多糖抗氧化活性对比同浓度Vc相对较弱，但其对DPPH清除能力较好，对羟基自由基离子及超氧根离子也具有一定的清除能力。

（收稿：2018-05-26）