提高质量和数量的肠系膜疏松结缔组织铺片制作方法

李 冰 骆倩倩 刘同慎

(滨州医学院实验教学管理中心, 烟台 264003)

疏松结缔组织的观察是组织学实验教学的重要内容之一,而实验中使用的铺片存在厚薄不均、有皱褶、染色易褪色等影响观察效果的问题,并且实验动物肠系膜利用率不高。现探讨了一种既能够保证质量,又能够一次性大批量制作铺片的方法,在组织学实验教学中具有广泛的推广和应用价值。

1 材料和方法

1.1 肠系膜扩展器的准备

选择1条12号或者13号(直径约0.25cm)铁丝(或者铜丝),长度100～110cm,要求平滑、无弯曲。首先对铁丝两端做圆滑处理,再在一端紧套一段软橡胶空心管,要求铁丝不得从管另一端穿出。将铁丝弯曲制作成螺旋弹簧(外径7～9cm、节距约0.5cm、总圈数约4圈),作为肠系膜扩展器(图1)。

1.2 实验动物的处理和肠系膜的取材

Wistar大鼠2只,体质量250～300g,雌雄不限。腹腔注射新配制的0.5%的台盼蓝生理盐水液每只3ml(1次/2天),共注射2次,于第2次注射后的第4天取材。1%的水合氯醛水溶液(150mg/kg)腹腔注射麻醉,颈总动脉放血处死。沿腹正中线打开腹腔,于十二指肠起始部和回肠末端分别剪断肠管,再剪断肠系膜根部(注意保持系膜根完整),将肠系膜和与其相连的肠管取下,放入培养皿中。生理盐水冲洗血液和污物多次。

1.3 肠系膜的铺展

使用肠系膜扩展器进行： 选择肠系膜相连肠管的任一断端,将扩展器的一端穿入肠腔,并小心沿肠管前行,逐渐将肠管全部套在扩展器的铁丝上(图2)。沿扩展器慢慢伸展肠管,并根据肠系膜的大小适当调节铺展器外径,将肠系膜整体展平(图4)。注意避免操作过程铁丝穿透肠壁和损伤肠系膜。

1.4 固定和染色

肠系膜固定和染色的全过程是将扩展器放入常规染色缸中进行(图3)。(1) Bouin氏固定液固定12～24h;(2) 75%乙醇浸洗30min(中间换液2次);(3) Weigert弹性纤维染色1h[1];(4) 蒸馏水速洗;(5) Harris苏木精染细胞核10min;(6) 0.5%盐酸乙醇(75%乙醇配制)分色;(7) 1%中性红(50%乙醇配制)染肥大细胞10min;(8) 蒸馏水速洗;(9) 1%焰红水溶液染胶原纤维和细胞质5min;(10) 蒸馏水速洗;(11) 95%乙醇、100%乙醇常规脱水,二甲苯透明。

1.5 浸胶、剪片和封片

(1) 将扩展器连同肠系膜浸入二甲苯稀释的中性树胶液(10%)中,5min取出,通风厨内自然干燥;(2) 沿肠管将肠系膜完整剪下,再剪切成大小适宜(约0.3cm×0.3cm)的小片,平铺在载玻片上,滴加中性树胶,盖上盖玻片封固。

2 结果

肉眼可见,扩展完成后的肠系膜是以系膜根为中心,沿扩展器向周围呈螺旋状伸展,长度约3圈;系膜平展透明,无皱褶,无破损(图4)。低倍镜下,肠系膜透明,纤维和细胞分散、分布均匀(图5)。高倍镜下,弹性纤维纤细,有分支,呈蓝色;胶原纤维粗细不等,但较弹性纤维粗,呈红色;2种纤维相互交织成网状(图6)。可见巨噬细胞和肥大细胞胞质内的颗粒具有显著差别： 巨噬细胞胞质内含有大小不一、分布不均、呈蓝色的台盼蓝吞噬颗粒;而肥大细胞胞质内含有的颗粒,大小一致,分布均匀,呈红色(图6)。成纤维细胞呈三角形或者多边形,界限清楚,有突起,细胞核呈蓝色,细胞质呈红色,部分细胞的胞质中可见少量台盼蓝颗粒(图6)。

3 讨论

小肠系膜即肠系膜是由2层间皮及其之间的疏松结缔组织构成,间皮菲薄,结缔组织平展,是制作疏松结缔组织铺片的良好材料。组织学实验教学中,观察疏松结缔组织使用的方法有撕片和铺片[2-3]。撕片是剪取动物的皮下结缔组织,在载玻片上用针将其撕开平摊制作而成,因此,对于疏松结缔组织成分的分布及其排列次序改变较大。而铺片,只是在疏松结缔组织原有分布状态下做了适当的伸展,故更适合于实验教学的使用。但是,将肠系膜铺平且厚薄均匀是铺片制作的关键。为此,曾有不少学者对于肠系膜疏松结缔组织铺片的制作方法,进行过探索,比如利用电胶木圈固定膜组织[4],或者使用蜡盘借助大头针固定肠管来展平肠系膜[3]等。虽取得较为满意的效果,但这些方法只是剪取部分肠系膜进行铺片,材料的利用率较低,最终制作铺片的量自然会较少。笔者首次发明和使用了肠系膜扩展器,可将肠系膜扩展制作成全系膜的整体铺片。既方便了后续的固定及其染色操作,也使得能够利用的肠系膜面积增加2～3倍。经过剪切,可以制作出大量的教学铺片,显著提高工作效率及肠系膜的有效利用率。而且,扩展器牵引肠管扩展肠系膜力量均匀,故铺片更加平展均匀,且无组织结构的破坏。

图1 肠系膜扩展器.图2 小肠肠管全部套入系膜扩展器.图3 常规染色缸中固定.图4 沿肠系膜扩展器展平并固定后的肠系膜.图5 低倍镜下肠系膜,×100.图6 高倍镜下肠系膜,×400。△： 胶原纤维;↑： 弹性纤维;←： 成纤维细胞;↓： 肥大细胞;→： 巨噬细胞.

疏松结缔组织铺片的染色方法采用多种染料组合的复合染色,笔者在实践过程中观察,大多数方法的重复性较差,铺片易出现部分褪色现象,为此本实验方法在染色方法上也进行了有益的探讨。Weigert染料特异性结合弹性纤维较为紧密,着色后水溶相或者脂溶相较难去除,只是酸乙醇有部分褪色作用,因此笔者首先进行弹性纤维和细胞核染色,再进行一次酸乙醇分色。但胶原纤维较难着色或者着色后很容易褪色,因此,把胶原纤维的染色放到最后进行,并且选用焰红将胶原纤维染为红色,来增加与弹性纤维的对比性。对于肥大细胞染色,本实验使用了中性红,以期使其胞质颗粒的着色与巨噬细胞胞质内的台盼蓝吞噬颗粒有明显的对比。染料的选择以及实验步骤的安排,经过实验证明,达到了预期的效果,并且重复性较好,铺片可以长久保存。

肠系膜经过延展后,虽然经过固定、染色、脱水和透明多步骤处理,但是仍然比较柔软,不方便剪片和封片,并且在封片过程中容易产生皱褶。为此,本方法在剪切之前对肠系膜增加了“浸胶工艺”。即将中性树胶浸入肠系膜,干燥后使系膜的硬度增加,后续的剪片和封片操作更为方便。封片后较少产生皱褶,显著提高铺片的质量。

实践证明,利用弹簧式扩展器制作的肠系膜铺片,在质量和数量上均有显著提高,在应用过程中应该特别注意以下问题： (1) 制造扩展器材料的粗细和硬度应适当,细软材料在后期系膜干燥后,扩展器容易变形引起系膜皱缩,粗硬材料制造的扩展器,其直径不易调节;(2) 肠管伸展均匀,才能够使肠系膜平展、厚薄均匀,故扩展器穿肠套管时,需要小心仔细,避免刺破肠壁发生某个方向牵引力的改变,导致肠系膜皱缩;(3) 肠系膜扩展定位后,可以用细线结扎固定肠管两端,防止肠管回缩;(4) 肠系膜在扩展器上扩展完成后,使用生理盐水再次清洁,并借用软毛笔刷洗去除渗出到其表面的少量炎性细胞和表面吸附的胎盘蓝染料;(5) 固定液的固定时间要足够,以保证肠系膜固定良好的同时,也使肠管得到硬化,防止肠管回缩引起的系膜皱缩。