抗菌肽Cn-AMP2双靶点抗菌机制的光谱学研究

王洁 ，吴琦 ，王宏兰 ，孙晓杰 ，衣同辉 ，郭红艳 ，齐晓丹 ，刘哲丞

1.齐齐哈尔医学院物理教研室，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院临床生物化学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161000；3.齐齐哈尔医学院生物化学实验室，黑龙江齐齐哈尔 161000；4.齐齐哈尔医学院生物化学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161000

传统抗生素的发现和应用为治疗感染性疾病提供了非常有效的途径，但是细菌对传统抗生素耐药性日益严重，这导致了人们对寻找新型作用靶点和作用机制的抗菌药物研究。抗菌肽具有不同于传统抗生素的作用机制，不易产生耐药性，是抗生素的理想替代药物[1]。Cn-AMP类抗菌肽来源于拉丁美洲的绿椰子汁液[2]。抗菌肽Cn-AMP2是一条11个氨基酸组成的酸性多肽（氨基酸序列：TESYFVFSVGM）。该文通过Fmoc固相合成法合成了抗菌肽Cn-AMP2并测定其在不同溶液体系中的二级结构；然后测定了抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性。使用不同光谱探针测定了其对细菌细胞膜和基因组DNA的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸、Rink amide MBHA树脂及2,2,2-三氟乙醇(TFE)购自吉尔生化(上海)有限公司;MH肉汤培养基购自北京陆桥技术有限公司。溴化乙锭和PBS溶液购置北京鼎国昌盛有限公司。

大肠埃希菌ML-35购自美国ATCC菌种保藏中心，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC227 853，铜绿假单胞菌ATCC9027，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，金黄色葡萄球菌ATCC25923，表皮葡萄球菌ATCC12228，藤黄微球菌ATCC4698，粪肠球菌ATCC 21912和枯草芽孢杆菌 ATCC6633购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2545制备型高效液相色谱（Waters公司，美国）;J-815型圆二色光谱仪(JASCO公司，日本)；UV-2550紫外分光光度计（岛津公司，日本）；RF-5301 PC型荧光分光光度计（岛津公司，日本）。

1.2 抗菌肽Cn-AMP2的合成与纯化

采用Fmoc固相多肽合成法合成多肽序列，使用Rink amide MBHA树脂为载体，9-芴甲氧羰基(Fmoc)-氨基酸为原料进行合成。合成结束后，粗肽用三氟乙酸（TFA）从树脂上切下来，利用2545制备型高效液相色谱进行制备。采用含0.1%TFA的双蒸水（A相）和含0.1%TFA的乙腈（B相）为流动相，用1 mL/min流速采用ACQUITY UPLC BEH300色谱柱进行梯度洗脱，收集纯品进行真空冷冻干燥得到多肽样品并进行质谱鉴定。

1.3 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌浓度MIC测定

将保存的菌株涂布LB固体培养基平板，于37℃培养24 h。挑取单克隆菌落接种MH液体培养基，37℃，180 rpm过夜振荡培养。用MH培养基将过夜培养的菌液稀释到 5×105CFU/mL，按 90 μL/孔加入到 96 孔细菌培养板中；将抗菌肽Cn-AMP2从1 mg/mL开始倍比稀释后，按10 μL/孔加入到菌液中；然后于 37℃，180 rpm，培养 24 h；测定 OD590nm，计算最低抑菌浓度MIC。重复操作3次，计算MIC平均值[3]。

1.4 抗菌肽Cn-AMP2二级结构测定

在25℃条件下，使用圆二色光谱仪测定抗菌肽Cn-AMP2的二级结构。分别在KP缓冲液(pH 7.0，50 mmol/L KH2PO4/K2HPO4,100 mmol/L KCl)及含有50%TFE的KP缓冲液中测定75 μmol/L多肽。测定波长范围OD190nm-OD250nm。使用摩尔椭圆率公式 [θ]=θ/10lCMn计算二级结构。

1.5 抗菌肽Cn-AMP2对细菌外膜渗透性实验

如果细菌外膜遭到破坏，N-苯基-1-萘胺 （N-phenyl-1-naphthylamine,NPN）会发出强烈荧光。选取大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，用含有5 mM NPN的pH 7.4，5 mM HEPES缓冲液调整对数生长期的细菌浓度调整为8×108CFU/mL后，加入终浓度为5 μg/mL，2.5 μg/mL和1.25 μg/mL的多肽进行测定。用生理盐水作为对照组。荧光测定的激发波长为350 nm、发射波长为420 nm。

1.6 抗菌肽Cn-AMP2与EB竞争性结合基因组DNA的荧光光谱

按照文献报道方法提取大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA。取浓度为500 μg/mL的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA溶液（含1.5 μg/mL EB）50 μL 加入加入等体积的抗菌肽 Cn-AMP2，37℃避光孵育10 min。用OD535nm波长激发，测量反应体系在OD550nm-OD750nm波长范围的荧光强度。

2 结果

2.1 抗菌肽Cn-AMP2的合成及纯化结果

使用Fmoc固相合成方式合成抗菌肽Cn-AMP2后，将冷冻干燥获得的粗肽用15%的乙腈溶解后，使用Waters 2545型高效液相色谱进行制备，收集多肽纯品并进行质谱鉴定（图1）。抗菌肽Cn-AMP2理论分子量为1 266.42 Da，质谱鉴定为1 266.40 Da（图2）。质谱鉴定结果表明多肽序列合成正确。

图1 抗菌肽Cn-AMP2纯化结果

图2 抗菌肽Cn-AMP2质谱鉴定结果

2.2 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌浓度MIC测定结果

采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽Cn-AMP2的最低抑菌浓度，实验结果表明抗菌肽Cn-AMP2对革兰阴性菌和革兰阳性菌都具有良好的杀伤效果，最低抑菌浓度在 50.0～100.0 μg/mL（表 1）。 实验结果说明抗菌肽Cn-AMP2是一条具有广谱抗菌活性的多肽。

表1 抗菌肽Cn-AMP2最低抑菌浓度MIC测定结果

2.3 抗菌肽Cn-AMP2二级结构测定结果

使用了KP缓冲液模拟生理环境，使用KP缓冲液/TFE混合溶液模拟细菌细胞膜疏水环境。在KP缓冲液中，抗菌肽Cn-AMP2在OD222nm波长处椭圆率为590 degree·cm2·dmol-1， 表明抗菌肽 Cn-AMP2 的结构为无规卷曲结构。但在KP缓冲液/TFE混合溶液，抗菌肽Cn-AMP2在OD222nm波长处椭圆率为-2 548 degree·cm2·dmol-1，表明抗菌肽 Cn-AMP2 的结构为螺旋结构（图3）。

图3 抗菌肽Cn-AMP2在不同溶液体系中的二级结构

2.4 抗菌肽Cn-AMP2对细菌外膜渗透性实验结果

细菌外膜渗透性实验中，当不同浓度的抗菌肽Cn-AMP2与大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作用后，荧光染料NPN产生了强烈荧光（图4、图5）。实验结果荧光染料NPN在2～3 min左右插入到细菌细胞外膜的疏水性核心区。说明细胞膜是抗菌肽Cn-AMP2的作用靶点之一。

图4 抗菌肽Cn-AMP2与大肠埃希菌细胞膜作用结果

图5 抗菌肽Cn-AMP2与金黄色葡萄球菌细胞膜作用结果

2.5 抗菌肽Cn-AMP2与EB竞争性结合基因组DNA的荧光光谱

抗菌肽Cn-AMP2加入到基因组DNA和溴化乙锭EB的混合体系后，EB-DNA复合体系的荧光强度发生明显的衰减，并且随着抗菌肽Cn-AMP2浓度增加荧光强度不断降低；说明抗菌肽Cn-AMP2与EE竟争性结合大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌基因组DNA，基因组DNA是抗菌肽Cn-AMP2的作用靶点之一[4]（图 6、图 7）。

图6 抗菌肽Cn-AMP2与大肠埃希菌基因组DNA作用结果

图7 抗菌肽Cn-AMP2与金黄色葡萄球菌基因组DNA作用结果

3 讨论

随着细菌耐药性问题的日益严重，抗菌肽的研究受到了广泛重视。抗菌肽杀伤病原菌的机理研究中，研究者多关注抗菌肽与细菌细胞膜的相互作用，并提出了“桶板模型”“地毯模型”“虫孔模型”和“膜区分模型”等来解释抗菌肽。随着研究的深入，基因组DNA,DnaK酶等胞内靶点也受到研究者的重视。抗菌肽PR-39和Lfcin等通过与胞内靶点结合，从而对细菌的基因表达及RNA转录等产生抑制作用，最终导致细菌死亡[5]。抗菌肽AN5-1和抗菌肽AN5-2则是对细胞膜和基因组DNA都产生作用，从而提高了抗菌活性[6]。

该次通过Fmoc固相合成的方式制备了抗菌肽Cn-AMP2，为了检测抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性，选取了8种临床常见的病原菌株。MIC测定结果表明抗菌肽Cn-AMP2对多种革兰阴性菌和革兰阳性菌具有杀伤作用，最低抑菌浓度为50.0～100.0 μg/mL。针对革兰阳性菌和革兰阴性菌比较，抗菌肽Cn-AMP2的抗菌活性无明显区别。以往文献报道中，抗菌肽Cn-AMP2对白色念珠菌等的抑菌浓度为80 μg/mL左右，说明抗菌肽Cn-AMP2具有广谱抗菌活性[7]。圆二色光谱测定表明抗菌肽Cn-AMP2在222nm波长处有特征吸收，说明其结构是α螺旋结构。目前已经发现的2 800多种抗菌肽中，α螺旋结构抗菌肽所占比例最高，说明抗菌肽Cn-AMP2的结构属于抗菌肽中最常见的二级结构。α螺旋结构抗菌肽的作用靶点多为细菌细胞膜，膜渗透性实验结果确认了细菌的细胞膜是Cn-AMP2的作用靶点之一。荧光光谱实验证明细菌基因组DNA是抗菌肽的另一个作用靶点，抗菌肽Cn-AMP2引发DNA结构发生变化，从而影响细菌基因组DNA的转录翻译，最终导致细菌死亡。这说明和抗菌肽AN5-1和NK-18相似，抗菌肽Cn-AMP2也是双靶点作用抗菌肽，但对于抗菌肽Cn-AMP2对基因组转录翻译的具体影响过程，尚需要进一步研究。