二甲戊灵胁迫对伊乐藻生理特性的影响

王燕　李蒙英　曲军辉　倪腾飞　谢立群

摘 要：本研究采用水培試验方法研究不同浓度二甲戊灵对伊乐藻植株叶绿素含量和2种抗氧化酶活性，以及丙二醛（MDA）、可溶性蛋白（SP）及脯氨酸（Pro）含量的影响。结果表明，（1）二甲戊灵可以抑制伊乐藻叶绿素a合成，促进叶绿素b合成，降低植物体光合能力；（2）在试验浓度范围内，伊乐藻SOD活性均低于CK，除第2天 F处理（4 mg·L-1）外，其余各组SOD活性在各测定时间内表现为浓度越高SOD活性越低；随着二甲戊灵浓度的升高，第2天时，除F处理（4 mg·L-1）外，其他各组伊乐藻POD活性与CK无显著差异，第4，6，8天，POD活性先升后降，第10天则呈降-升-降的趋势；（3）处理后第10天，随着二甲戊灵浓度的增加，伊乐藻体内丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量先升后降，分别至1 mg·L-1和2 mg·L-1达到最高，可溶性蛋白（SP）含量呈降低-升高-降低的趋势，且各处理均显著低于CK。上述结果均说明二甲戊灵影响了伊乐藻正常的生理代谢活动。

关键词：伊乐藻；二甲戊灵；胁迫；生理特性

中图分类号：Q949.71+2.7 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.003

Effects of Pendimethalin Stress on Physiological Characteristics of Elodea nuttallii

WANG Yan1， LI Mengying2， QU Junhui2， NI Tengfei2， XIE Liqun1

（1. Gold Mantis Architecture College， Soochow University， Suzhou， Jiangsu 215123， China；2. Basic Medical and Biological Sciences College， Soochow University， Suzhou， Jiangsu 215123， China）

Abstract： The experiment was conducted with the hydroponics method， and the effects of different concentrations of pendimethalin on physiological characteristics of Elodea nuttallii were studied， including chlorophyll content， two kinds of antioxidant enzyme activities， and the content of malondialdehyde （MDA）， soluble protein （SP） proline （Pro） in the plant. The results showed that， under the pendimethalin treatment， the synthesis of chlorophyll a was inhibited， while the synthesis of chlorophyll b was promoted， the plant photosynthetic capacity was reduced. In the range of experimental concentration， the activity of SOD activity was lower than that of CK， and the SOD activity showed that SOD activity was lower when pendimethalin concentration was higher in each test time except for the 2nd day of F treatment （4 mg·L-1）. With the increase of pendimethalin concentration， on the 2nd day， except for F treatment （4 mg·L-1）， the activity of POD activity in other groups had no significant difference with CK， on the 4th day， 6th day and 8th day， the activity of POD first increased and then decreased， on the 10th days， the activity of POD showed a decrease-increase-decrease trend. On the 10th day after pendimethalin treatment， with the increase of pendimethalin concentration， the content of malondialdehyde （MDA） and proline （Pro） increased first and then decreased， and reached the highest level under 1 mg·L-1 and 2 mg·L-1 treatment respectively， soluble protein （SP） content showed a decrease-increase-decrease trend， and all treatments were significantly lower than CK. All these results indicated that pendimethalin affected the normal physiological and metabolic activities of Elodea nuttallii.

Key words： Elodea nuttallii； pendimethalin； stress； physiological characteristics

二甲戊灵是世界第三大除草剂，在国内外应用较广。由于二甲戊灵的大量使用，其残留不仅存在于土壤及农作物，也随着地表径流进入湖泊、河流等水域中[1-2]，给水环境带来了一定的污染，早在1983年，Isensee和Dubey[3]研究了二甲戊灵对水生生态系统的影响，结果表明，它对水生生物高毒，引起了人们对二甲戊灵使用的注意。沉水植物的生活周期主要在水层下方， 生理上极端依赖水环境， 因而对环境胁迫的反应极为敏感[4]，目前，由于水生态环境的恶化，造成沉水植物退化加剧，对其退化原因的研究主要集中在水体的富营养化及重金属等方面[5-6]，但与除草剂污染的相关性研究较少。伊乐藻为多年生沉水植物，在水体景观方面应用广泛，且常用于水体净化。本试验以伊乐藻为试材，研究其对二甲戊灵胁迫的耐受性，以期为除草剂残留情况下沉水植物的退化原因提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试药品为99%二甲戊灵粉剂，由江苏龙灯化学有限公司生产。用甲醇溶液配置二甲戊灵1 000 mg·L-1，储存于冰箱中备用。伊乐藻采自苏州大学独墅湖校区池塘，将采集的植物材料置于含有1/10的霍格兰氏（Hoagland）营养液塑料容器中，在实验室适应性培养2周；选择一定量生长良好、生长状况一致的植物个体，分成14等份，清水洗净后植于含有培养液500 mL的三角瓶中，于光照培养箱中驯化一周。

1.2 处理方法

采用室内水培试验，将驯化好的植物分别置于14个500 mL盛有培养液的三角瓶中，其中二甲戊灵浓度分别为0（CK），0.1（A），0.2（B），0.5（C），1.0（D）， 2.0（E），4.0 mg·L-1（F），每个处理设2个平行，培养箱温度为22～26 ℃，光暗比为14/10，定期添加蒸馏水以补充挥发的水分。试验周期为10 d，分别在处理的第3天和第6天测定不同处理组植株叶绿素含量；在处理的第0，2，4，6，8， 10天测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量以及过氧化物酶（Peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性；在试验结束时测定可溶性蛋白（Soluble protein，SP）和脯氨酸（Proline，Pro）含量。

1.3 试验方法

叶绿素含量的测定采用丙酮乙醇混合液法，丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸显色法，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定，可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250法，脯氨酸测定采用酸性茚三酮显色法[7]。每次测定重复3次，取平均值。

1.4 数据处理和统计分析

数据处理及绘图采用Microsoft Excel 2016，数据统计分析采用SPSS 17.0软件，多重比较采用LSD最小显著差数法[8]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度二甲戊灵对伊乐藻叶绿素含量的影响

从表1可知，第3天时，处理A和B组伊乐藻体内叶绿素含量分别为CK的100.71%和100.79%，且与CK差异不显著，表明，试验初期，浓度≤0.2 mg·L-1的二甲戊灵胁迫对伊乐藻总叶绿素合成的影响较小；而浓度≥0.5 mg·L-1的二甲戊灵处理C、D、E、F叶绿素含量显著低于CK，分别为CK的92.56%，91.50%，91.85%和92.87%，各处理间差异不显著，说明在此浓度范围二甲戊灵胁迫显著降低了伊乐藻叶绿素含量。处理第6天时，伊乐藻叶绿素含量呈逐渐下降趋势，处理A、B、C、D、E、F叶绿素含量分别为CK的99.72%，93.98%，91.95%，79.29%，65.64%和54.51%，除了处理A与CK之间差异不显著外，其他处理与CK差异均达显著水平，表明随着胁迫时间的延长，二甲戊灵对伊乐藻叶绿素含量的抑制作用增强。在整个试验过程中，随胁迫浓度的增加，伊乐藻叶绿素a含量呈现逐渐下降趋势，而叶绿素b含量呈逐渐增加趋势，各处理叶绿素a/ b均显著低于CK。

2.2 不同浓度二甲戊灵对伊乐藻丙二醛（MDA）含量的影响

从图1可知，不同处理在各处理时间，伊乐藻MDA含量均有不同程度的增加。第2天时，浓度≥0.5 mg·L-1的二甲戊灵胁迫，伊乐藻MDA含量显著增加，而浓度≤0.2 mg·L-1的二甲戊灵胁迫处理，MDA含量仅略高于CK，但差异不显著。随着胁迫时间（4～10 d）延长，浓度≤1 mg·L-1的二甲戊灵处理组，MDA含量呈逐渐升高的趋势，且各组MDA含量在同一测定时间内表现出一定的剂量—效应关系，即浓度越高，MDA含量也越高，第10天时处理A、B、C、D 组MDA含量分别是CK的1.28，1.57，1.58，1.71倍，除了处理B、C差异不显著外，其他处理间的差异均达显著水平；而在浓度≥2 mg·L-1的二甲戊灵处理组，MDA含量在第6天时达到最大值，处理E、F 组MDA含量分别是CK的1.65，1.90倍，第8天后缓慢降低，但仍显著高于对照。

2.3 不同浓度二甲戊灵对伊乐藻抗氧化酶活性的影响

2.3.1 超氧化物歧化酶（SOD） 从图2可知，不同浓度二甲戊灵处理组的各处理时间，伊乐藻SOD活性均低于CK，且隨着处理时间的延长，均呈先升后降的趋势，A、B、C、D、E和F组分别于第4、6、6、4、6和6天 达到最大值，分别为CK的95.24%，96.08%，77.52%，61.19%，47.22%和44.33%，各处理均于第10天时伊乐藻SOD活性达到最小值，A、B、C、D、E和F处理组SOD活性分别为CK的47.74%，36.47%，31.96%，20.08%，18.44%，13.72%，且除D（1 mg·L-1）和E（2 mg·L-1）处理组间差异不显著外，其他各组间差异均达显著水平；试验期间，除第2天时的F处理（4 mg·L-1）外，其余各组的SOD活性在各测定时间内表现出一定的剂量—效应关系，即浓度越高，SOD活性越低。

2.3.2 过氧化物酶（POD） 从图3可知，随着处理时间的延长，不同浓度二甲戊灵处理组伊乐藻POD活性均呈先升后降的趋势，A、B、C、D、E和F组分别于第6、8、8、4、4和4天达到最大值，分别为CK的112.88%，159.14%，147.31%，189.98%，153.61%和137.35%。随着二甲戊灵浓度的升高，第2天时，除4 mg·L-1处理组伊乐藻POD活性显著高于CK外，其他各处理组与CK差异均不显著，说明试验初始阶段4 mg·L-1二甲戊灵对POD活性有显著诱导作用；第4、6和8天伊乐藻POD活性呈先升后降的趋势，分别于D（1 mg·L-1）、D（1 mg·L-1）、B（0.2 mg·L-1）时达到最大值，分别为CK的189.76%，171.77%，159.13%；而第10天则呈降-升-降的趋势，至D （1 mg·L-1）处理达到最大值，为CK的139.63%。

2.4 不同浓度二甲戊灵对伊乐藻可溶性蛋白含量（SP）的影响

从图4可知，各处理伊乐藻SP含量均显著低于CK，且随着二甲戊灵浓度的增加，伊乐藻SP含量呈降低-升高-降低的趋势，处理A、B、C、D、E和F的SP含量分别为CK的92.07%，82.92%，76.82%，81.09%，86.58%和62.19%。

2.5 不同浓度二甲戊灵对伊乐藻脯氨酸（Pro）含量的影响

从图5可知，各处理伊乐藻Pro含量均显著高于CK，且随着二甲戊灵胁迫浓度的增加，伊乐藻植株Pro含量呈先上升后下降的趋势，至E处理（2 mg·L-1）达最大值，处理A、B、C、D、E和F的Pro含量分别为CK的118.06%，37.04%，141.36%，150.19%，165.01%和123.64%，表明二甲戊灵胁迫超过一定的浓度时，对伊乐藻体内Pro含量具有抑制作用。

3 结论与讨论

叶绿素是植物体内进行光合作用的主要色素，其含量高低在一定程度上反映了光合作用水平。叶绿素含量低，光合作用弱，会导致植物鲜质量降低，使植物不能正常代谢[9]。高等植物参与光合作用的主要色素包括叶绿素a、叶绿素b，叶绿素a/ b值的变化，能反映叶片光合活性的强弱[10]。在整个试验过程各处理组伊乐藻叶绿素a/ b均显著低于对照，说明其光合作用受到抑。许多研究表明，逆境胁迫都能引起叶绿素破坏，光合性能下降[11]。本试验中，伊乐藻叶绿素含量除0.1 mg·L-1处理3 d、6 d和0.2 mg·L-1处理2 d时与CK无显著差异，其他均显著降低（表1），这与Kolte和Goyal[12]通过蓝藻评价二甲戊灵对植物毒性的研究结论一致；随着二甲戊灵浓度的增加，伊乐藻叶绿素a含量降低，而叶绿素b含量增加，导致各处理组叶绿素a/ b均显著低于CK，说明伊乐藻光合作用显著受到抑制，表现出明显的毒害症状。

植物器官衰老或在逆境条件下，会发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，能与细胞内的各种物质发生强烈反应，引起对酶和膜的严重损伤，其含量水平通常可反映植株遭受氧化胁迫的程度[13-14]。本试验中，二甲戊灵各浓度在不同的处理时间，伊乐藻丙二醛含量均有不同程度的增加，推测在二甲戊灵胁迫过程中，可能产生大量活性氧、自由基引发膜质过氧化作用，使膜的正常结构和功能受损，这与张威的研究结果一致[15]；随着二甲戊灵处理时间（4～10 d）的延长，浓度≤1 mg·L-1的处理组伊乐藻MDA含量呈逐渐升高的趋势，而浓度≥2 mg·L-1的处理组则呈现先升高后降低趋势，可能是因为二甲戊灵超过了一定浓度，对伊乐藻造成不可逆的损伤，从而使MDA含量降低。

在逆境胁迫条件下，SOD和POD活性的变化可以反映细胞清除活性氧的能力，二者在植物的抗逆性研究中颇受重视，在许多植物的研究中均有报道[16-17]。SOD是一种典型的诱导酶，能催化超氧阴离子自由基的歧化反应而形成O2和H2O2，从而减轻O2-对植物的毒害[18]，其活性变化在一定程度上反映了植株受胁迫的变化程度。本试验中，不同浓度二甲戊灵处理组的各处理时间，伊乐藻SOD活性均低于CK，且随着处理时间的延长，均呈先升后降的趋势；可能是因为植物体在受到二甲戊灵胁迫时，对有害胁迫产生一定的适应性阶段，随着胁迫时间的延长，膜结构造成一定程度损伤，产生大量的活性氧、自由基，引发SOD活性短时升高，以减少对植株的伤害，随着胁迫时间的进一步延长，植株受到不同程度的损伤，从而导致活性下降。除第2 天时的F处理（4 mg·L-1）外，其余各组的SOD活性在各测定时间内表现出一定的剂量—效应关系，即浓度越高，SOD活性越低。可能胁迫浓度越高，对植株损伤程度越大，从而导致SOD应激反应越弱。POD是抗氧化系统中的重要保护酶，可有效地清除各种环境胁迫下植物体内产生的活性氧，从而阻抑膜脂过氧化的进程，以降低对植物自身的毒害，维持质膜透性及自由基之间的动态平衡，保证植物进行正常的新陈代谢[19]。正常情况下，植物体内POD活性维持一定水平，以去除不断产生的活性氧，使植物体内POD活性和活性氧含量达成一定平衡关系[20]。许多研究[21-22]都表明，植物体内POD活性变化存在先扬后抑的过程，即在轻度胁迫下，植物体本身能提高等保护酶活性，以清除有害物質，但随着胁迫的加强，最终导致活性下降。在本试验中，随着二甲戊灵浓度的升高，第4 、6 和8 天伊乐藻POD活性呈先升后降的趋势，证明了上述结论；但第2天时，除4 mg·L-1处理组伊乐藻POD活性显著高于CK外，其他各处理组与CK差异均不显著，可能是由于植株体内活性氧含量升高，从而引发POD活性升高，以去除不断产生的活性氧；而第10天则呈降-升-降的趋势，这可能是由于较低浓度二甲戊灵胁迫下，植株有效低抵抗了胁迫，而D（1 mg·L-1）处理对植物仍然产生损害，随着胁迫浓度升高，E（2 mg·L-1）、F（4 mg·L-1）高浓度处理可能对植株产生不可逆的损伤，从而导致POD活性降低。

生物体在正常代谢过程中，可通过有机渗透调节物质的积累和分解来调节细胞渗透平衡，从而缓解盐胁迫对植物的伤害。脯氨酸和可溶性蛋白是植物体内最重要的渗透调节物质，可以作为细胞质的渗透调节物质和防脱水剂参与维持细胞的含水量和膨压；此外脯氨酸可以改善细胞膜和其他高分子物质的水环境，增强细胞结构的稳定性[23]。本试验中，随着二甲戊灵处理浓度的增加，伊乐藻SP含量呈降低-升高-降低的趋势，各处理均显著低于对照组，易冕[24]、龙瑞[25]等在研究重金属Mn、Cd胁迫对伊乐藻毒害研究中也得到类似的结论；Pro含量呈先上升后下降的趋势，表明在一定浓度范围内，伊乐藻可以通过细胞内Pro的积累来抵御胁迫，这与张义贤和张丽萍[24]的研究结果类似，说明伊乐藻可以通过提高脯氨酸的含量提高细胞的渗透势，维持细胞代谢，从而提高其抗逆性。

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