饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛肌肉组织及皮下脂肪中脂肪酸组成及其相关基因表达的影响

2018-10-08王钧艺严昌国李香子

动物营养学报 2018年9期

闫研于伽王钧艺严昌国李香子

(延边大学农学院，延边黄牛肉牛科学与产业协同创新中心，延吉133000 )

近年来，随着生活品质的提高，人们越来越关注畜产品安全与健康。脂肪酸对人类健康的影响一直受到广泛关注，牛肉脂肪组织中一些脂肪酸如油酸和共轭亚油酸(CLA)的异构体[1]对机体健康很有益处，这使得牛肉深受人们喜爱。肉牛脂肪组织中的脂肪酸组成是影响肉品质的重要指标[2]。研究表明，对饲粮中脂肪含量的调整可增加牛肉的营养价值，改变脂肪酸组成，从而更有益于机体的健康[3]。Petri等[4]通过饲喂富含亚油酸或亚麻酸的植物油或油料种子增加反刍动物脂肪代谢中产生的油酸和CLA；林凤英等[5]在饲粮中添加富含不饱和脂肪酸(UFA)，尤其是单不饱和脂肪酸(MUFA)的全脂油籽改变了反刍动物体组织中脂肪酸组成，并通过种皮的特性来影响瘤胃微生物氢化作用。

大量研究表明，脂肪酸参与调节与脂质代谢相关的基因表达和转录[6-7]。其中，固醇调节元件结合蛋白(SREBP)能够促进脂滴的合成，显著促进前体脂肪细胞的分化，并诱导成纤维细胞向脂肪样细胞的转化[8]；CCAAT增强子结合蛋白(CEBPS)是增强子结合蛋白家族，是脂肪细胞生成及分化过程中起重要调节作用的转录因子[9]；短链脂肪酸受体(GPR43)与脂肪细胞的分化有着密切的相关性，三者都对脂肪的调控有着重要的作用。

目前，关于补饲亚麻籽对肉牛脂肪组织代谢影响的报道较少，因此，本试验通过在延边黄牛的饲粮中添加不同处理(物理破碎法)的亚麻籽，探究其对延边黄牛肌肉组织及皮下脂肪中的脂肪酸组成及其相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择健康无病、平均体重在480 kg、体况相近的延边黄牛阉牛30头。由延边大学延边黄牛科技示范园提供。

1.2 试验设计

将30头延边黄牛阉牛随机分成3组，每组10头。对照组(CON)饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加8%整粒亚麻籽(WPS组)和8%破碎亚麻籽(PS组)的试验饲粮。试验过程中除饲粮组成不同以外，其他条件均保持一致，以控制单一变量。预试期10 d，正试期180 d。基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.3 饲养管理

圈舍保持清洁，保证试验动物能够自由饮水，温度适宜，光照充足，相对湿度为55%，并且每天在05:00和17:00饲喂精粗混合饲粮，自由采食。

1.4 样品采集及处理

试验结束在各组试验牛中分别挑选3头牛，体况相近，且体重接近各组的平均值，在空腹24 h以后进行流水线式屠宰。屠宰结束后取背最长肌(第12～13肋骨)肌肉组织和皮下脂肪组织，一部分封袋-20 ℃保存，用于测定脂肪酸含量；一部分液氮保存，用于测定相关基因的表达。

1.5 测定指标

1.5.1 生长性能的测定

分别在试验期开始和屠宰前进行体重测定，连续2 d在早饲前空腹称重，取平均值计算平均日采食量。每天精准称量并记录每组试验的投料量与剰料量，并测定其干物质的含量，以计算每头牛的平均日采食量，并计算饲料利用率。

饲料利用率(%)=(平均日增重/ 平均日采食量)×100。

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of the diet:VA 5 000 IU,VD 700 IU,VE 30 IU,Zn 100 mg,Fe 90 mg,Mn 20 mg,Cu 10 mg,I 0.3 mg,Se 0.2 mg。

2)综合净能(NEmf)为计算值，计算公式为：NEmf=DE×Kmf，Kmf=Km×Kf×1.5/(Kf+0.5×Km)。式中：NEmf是综合净能；Kmf是消化能转化为净能的效率；DE是饲粮消化能；1.5为饲粮水平值；Km和Kf分别是消化能转化为维持净能的效率和消化能转化为增重净能的效率。The combined net energy (NEmf) is a calculated value. The calculation formula is: NEmf=DE×Kmf，Kmf=Km×Kf×1.5/(Kf+0.5×Km). In the formula: NEmfis the combined net energy, Kmfis the efficiency of the conversion of digestible energy into net energy, DE is the digestibility energy of diets, and 1.5 is the dietary level value. Kmand Kfare the efficiency of digestive energy conversion to maintain net energy and net energy for gain, respectively.

1.5.2 肌肉组织及皮下脂肪中脂肪酸含量的测定

提取脂肪：磨碎样品，取1 g于50 mL离心管中，加内标1 mL，再用15 mL萃取液萃取，即氯仿甲醇(氯仿∶甲醇=2∶1)，再用搅拌器充分搅拌，热水冲洗后用氯仿甲醇冲洗，充分提取，振荡1 h，再加入10 mL 0.88%的氯化钠，漩涡振荡并离心，取上清液于酯化管中。

酯化过程：将酯化管中的上清液进行氮吹，在氮吹仪上55 ℃恒温吹干，自然冷却，加4 mL盐酸甲醇，75 ℃水浴锅中催化，再冷却至室温，加入2 mL正己烷，漩涡振荡后静止0.5 h，加4 mL饱和氯化钠，振荡静置待分层，离心，取上清液，使用安捷伦气相色谱仪GC-7890A测定脂肪酸含量。

1.5.3 肌肉组织及皮下脂肪相关基因表达量的测定

总RNA提取和cDNA合成：使用Promega Eastep的总RNA提取的试剂盒来提取肌肉和脂肪组织中的总RNA。再根据TaKaRa RR047A(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)试剂盒说明书，建立20 μL的反转录体系，将提取的总RNA反转录为cDNA，4 ℃保存。

表2 RT-PCR引物序列

1.6 数据处理

采用SPSS 19.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析，结果用平均值±标准误表示。P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛脂肪酸每日摄取量的影响

由表3可知，添加亚麻籽以后，与CON组比较，WPS组和PS组的黄牛每日摄入的脂肪酸含量均增加，其中C6∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶2n-6、C18∶3n-3和C18∶3n-6含量显著增加(P<0.05)。

2.2 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛生长性能的影响

由表4可知，与CON组相比，WPS组和PS组的平均日增重分别显著提高了6.25%和16.67%(P<0.05)，但WPS组和PS组的平均日增重差异不显著(P>0.05)；WPS组和PS组的平均日采食量分别显著提高了6.02%和15.05%(P<0.05)，但WPS组和PS组的平均日采食量差异不显著(P>0.05)；WPS组和PS组的饲料利用率无显著差异(P>0.05)。

2.3 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛肌肉组织中脂肪酸组成的影响

由表5可知，与CON组相比，WPS组和PS组C16∶0和C18∶0为主的饱和脂肪酸含量显著下降(P<0.05)，以C18∶1n-9、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶2trans-10,cis-12为主的单不饱和脂肪酸含量显著上升(P<0.05)，单不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸显著上升(P<0.05)。

表3 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛脂肪酸每日摄取量的影响

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表4 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛生长性能的影响

表5 饲粮中添加亚麻籽对延边黃牛肌肉组织中脂肪酸组成的影响

续表5项目Items组别 GroupsCONWPSPSC18∶2n-66.69±0.037.14±0.467.38±0.02C18∶2cis-9,trans-11 1.09±0.04b1.68±0.03a1.61±0.97aC18∶2trans-10,cis-12 1.46±0.27b2.66±0.08a1.99±0.92bC18∶3n-34.56±0.020.93±0.231.09±0.08C20∶00.02±0.050.04±0.020.04±0.92C20∶21.51±0.541.52±0.041.70±0.54C22∶03.52±0.053.99±0.524.01±0.22C20∶4n-60.01±0.240.02±0.040.02±0.85C20∶5n-30.02±0.540.03±0.250.03±0.74C22∶ln-90.87±0.711.05±0.541.07±0.56C22∶6n-30.02±0.590.02±0.360.02±0.35饱和脂肪酸 SFA43.16±0.34a34.83±0.59b34.78±0.46b单不饱和脂肪酸 MUFA43.45±0.37b50.20±0.74a50.47±0.34a单不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸 MUFA/SFA1.00±0.01a1.44±0.23b1.45±0.14b

2.4 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛皮下脂肪中脂肪酸组成的影响

由表6可知，与CON组相比，WPS组和PS组单不饱和脂肪酸C18∶ln-9、C18∶2n-6、C18∶2cis-9，trans-11、C18∶3n-3的含量显著上升(P<0.05)，饱和脂肪酸C10∶0、C12∶0、C16∶0、C18∶0含量显著下降(P<0.05)。

表6 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛皮下脂肪中脂肪酸组成的影响

续表6项目Items组别 GroupsCONWPSPS饱和脂肪酸 SFA43.66±4.0239.52±7.2640.31±5.49单不饱和脂肪酸 MUFA43.49±7.6446.63±6.2147.62±4.85单不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸MUFA/SFA0.99±0.791.18±0.861.18±0.88

2.5 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛肌肉组织中相关基因表达的影响

由表7可知，与CON组相比，WPS组和PS组的4种基因表达量均显著下调(P<0.05)，其中PS

组的GPR43和CEBPα基因表达量显著下调(P<0.05)，WPS组的SREBP和CEBPβ基因表达量显著下调(P<0.05)。

表7 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛肌肉组织中相关基因表达的影响

2.6 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛皮下脂肪中相关基因表达的影响

由表8可知，与CON组相比，WPS组GPR43和CEBPα基因表达量显著上调(P<0.05)，而PS组SREBP和CEBPβ基因表达量显著上调(P<0.05)。

表8 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛皮下脂肪中相关基因表达的影响

3 讨论

3.1 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛生长性能的影响

本试验中不同处理的亚麻籽均使延边黄牛的平均日增重升高，这与Raes等[10]在饲粮中添加不同处理的亚麻籽可提高肉牛的日増重结果一致。Landblom等[11]在饲粮中添加12.5%亚麻籽可显著提高肉牛的日增重。李建国等[12]研究也显示，饲粮中添加亚麻籽可增加能量利用率从而提高日增重。

本试验结果表明，在饲粮中添加亚麻籽可提高平均日采食量，这与许蕾蕾等[13]研究结果相一致。在饲粮中添加亚麻籽可增加不饱和脂肪酸的含量，从而提高平均日采食量和平均日增重，对饲料利用率无显著影响。但目前大量研究表明，在饲粮中添加亚麻籽对动物采食量的影响结果不一致。Cooper等[14]研究结果显示，动物采食量和生长性能与油料作物关系影响不大。所以，今后还将继续研究在饲粮中添加亚麻籽对肉牛采食量的相关性影响。

3.2 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛肌肉组织及皮下脂肪中脂肪酸组成的影响

亚麻籽中有大量的油脂，而油脂内的不饱和脂肪酸含量高达80%，其中α-亚麻酸占据主体，还有大量的亚油酸[15]。在反刍动物的瘤胃中亚麻酸会通过瘤胃微生物的不完全氢化作用生成共轭脂肪酸(CLA和CLNA)，这2种不饱和脂肪酸在反刍动物的体内非常重要，有很好的研究前景。而共轭脂肪酸的形成有2种途径，内源合成和瘤胃的不饱和氢化作用。

亚麻酸是反刍动物内源合成共轭亚麻酸的前体物，亚麻籽中的α-亚麻酸和亚油酸分别是n-3多不饱和脂肪酸和n-6多不饱和脂肪酸的合成前体，由于动物不能自身合成，所以亚麻酸是动物机体的必需脂肪酸[16]。罗何峰等[17]研究发现，在饲粮中添加n-3不饱和脂肪酸能够调控动物机体脂肪代谢的相关基因的表达，继而影响动物机体的体脂沉积。

本试验结果发现，与CON组相比，WPS组和PS组延边黄牛肌肉组织中C16∶0和C18∶0为主的饱和脂肪酸含量显著下降，以C18∶1n-9、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶2trans-10,cis-12为主的单不饱和脂肪酸含量显著上升。与CON组相比，WPS组和PS组延边黄牛皮下脂肪中C18∶ln-9、C18∶2n-6、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶3n-3等单不饱和脂肪酸的含量显著上调，C16∶0，C18∶0等饱和脂肪酸含量显著下调。这与张玉斌等[18]发现奶牛饲粮中添加油籽能够降低乳脂中C10∶0、C12∶0、C14∶0以及C16∶0等含量，增加C18∶1和C18∶1trans-11含量的结果一致。这说明饲粮中添加亚麻籽，确实改变了脂肪酸的组成，增加了亚麻酸在瘤胃中的饱和氢化作用，从而提高了不饱和脂肪酸的含量。亚麻籽补充剂促进饮食脂质的摄取，同时控制脂肪组织中的脂肪酸生物合成，这与于伽等[19]研究的结果保持一致。

3.3 饲粮中添加亚麻籽对延边黄牛肌肉组织及皮下脂肪中相关基因表达量的影响

GPR43、SREBP、CEBPS等基因在细胞间的信号传导和转化途径中可以被脂肪酸的组成所影响，它们参与脂肪细胞合成与分化的调控机制，与脂滴的聚积有着密切的关系[20]。其中，GPR43基因广泛存在于机体的脂肪组织、肠胃环境、免疫细胞等不同的组织和细胞之中，它能够被短链脂肪酸激活[21]。在小鼠上的研究发现，GPR43基因主要在小鼠的白色脂肪组织中表达，并且其在脂肪细胞中表达的水平要比其在血管基质细胞中的表达量高[22]。

GPRS是蛋白偶联受体家族中的一员，在介导细胞间的信号传导中起到重要的调控作用。由于其编码基因的位置在特定染色体上，所以其被称为特异性受体，又叫为游离脂肪酸受体[23]。又因为这种受体在机体很多组织包括脂肪、免疫细胞、肺等组织中表达，因此具有许多的生物学功能，参与了细胞的脂质代谢、免疫细胞的分化等过程。短链脂肪酸(SCFAs)不仅能为机体供能，还有很重要的生理调控作用，例如调控细胞增殖分化、凋亡、免疫反应和脂类的代谢等[24]。研究表明，GPR43是SCFAs的受体，SCFAs能与GPR43结合发挥很重要的生理功能。GPR43与脂肪细胞的分化有着密切的相关性。本试验结果显示，与CON组相比，WPS组和PS组肌肉组织中GPR43基因表达量下调，而皮下脂肪中的GPR43基因表达量上调。脂肪酸组成中单不饱和脂肪酸含量上升，饱和脂肪酸含量下降，同时相关基因GPR43基因的表达发生了变化，在脂肪细胞中的表达量更高，在肌肉中的表达量则下降，说明添加亚麻籽可以使脂肪酸组成发生变化，调控延边黄牛的脂质代谢。这与王蔚盈[25]研究结果基本一致。

SREBP是机体重要的核转录因子，与机体脂肪生成基因的调节有很重要的相关性，有大量的研究表明，SREBP可以直接激活脂肪酸、胆固醇、甘油三酯以及磷脂的生物合成及摄取过程中的30多个基因及还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的表达[26]，SREBP1或SREBP2基因的增加显著促进细胞脂滴的积累[27]。李丽等[28]研究发现SREBP第5内含子与C16∶1、C18∶0、SFA和甘油三酯及C16脂肪酸不饱和指数有显著的相关性。本试验结果显示，在饲粮中添加亚麻籽，与CON组相比，试验组的SREBP基因表达量显著上升，而C16∶1和C18∶0等饱和脂肪酸含量又呈显著下降趋势，C18∶ln-9、C18∶2n-6、C18∶2cis-9,trans-11、C18∶3n-3等单不饱和脂肪酸含量显著上升，说明基因表达量的变化与脂肪酸结构的存在相关性。

CEBPS是脂肪细胞生成及分化过程中起重要调节作用的转录因子[29]。而CEBPA基因和CEBPB基因都是CEBPS家族成员，在脂肪等组织的生长、分化及代谢中至关重要[30]。CEBPA对转录的调控表现在2个方面，即转录激活和转录抑制，同时也在细胞的增殖分化、能量代谢、信号传导等方面有重要作用[31]。本试验研究结果显示，与CON组相比，在饲粮中添加亚麻籽显著提高CEBPA和CEBPB基因的表达，试验组的单不饱和脂肪酸含量也显著上升，说明饲粮添加亚麻籽可以调控脂肪酸的组成及相关基因的表达量。