强烈炽热球菌几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成与结构分析

程 功，焦思明，任立世，冯 翠，康跻耀，杜昱光*

（中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190）

壳寡糖是由氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖或者二者的组合通过β-1,4糖苷键连接形成的寡聚物，聚合度小于20，相对分子质量小于3 900；通常由甲壳素或者其脱乙酰产物壳聚糖经过酸水解、物理水解或酶解等方法获得[1]。壳寡糖具有调节免疫、抗肿瘤及诱导植物抗病抗逆与促进植物生长等生物活性[2-6]。与动植物及人体中的特定受体结合是壳寡糖发挥上述生物活性的重要方式。目前，已有多种可与壳寡糖特异性结合的受体被发现。比如，壳寡糖可与甘露糖受体特异性结合并激活巨噬细胞，其中，N-乙酰氨基葡萄糖在壳寡糖与甘露糖受体结合过程中发挥决定性作用[7-8]。在人体中还存在多种几丁质凝集素，如YKL-39及YKL-40等，在炎症发生、细胞增殖及自身免疫性疾病发生过程中发挥重要作用，均已被证实具有壳寡糖结合活性，且N-乙酰氨基葡萄糖在其中也起到决定性作用[9-11]。在植物中，已经鉴定出多种可与壳寡糖特异性结合的受体，如水稻几丁质受体OsCEBiP及几丁质和肽聚糖的共受体OsLYP4/OsLYP6等[12-15]。这些植物受体的共同特征是都具有可专一识别N-乙酰氨基葡萄糖的LysM结构，进一步说明该单糖组分在该类型配体受体识别过程中的决定性作用[16-17]。

在工业上，通常将甲壳素经碱法脱乙酰获得壳聚糖，再经过酶法水解获得壳寡糖[18-19]。由于使用的化学脱乙酰过程为非匀相反应过程，仅能获得脱乙酰度大于85%的酸溶壳聚糖，以其为原料进一步水解获得的壳寡糖脱乙酰度也大于85%。由于这些商品壳寡糖中所含的N-乙酰氨基葡萄糖组分已经较少，与专一性识别该单糖组分的特定受体的结合能力也相应较低，难以充分发挥其生物活性。因此，以低脱乙酰度（如脱乙酰度小于70%）壳聚糖为底物，通过酶解制备获得富含N-乙酰氨基葡萄糖的壳寡糖，可能最大程度发挥其生物活性。目前，壳寡糖的活性及功能研究主要还是集中在高脱乙酰壳寡糖，低脱乙酰度壳寡糖的制备及功能研究仍然十分缺乏。

传统方法制备的高脱乙酰度壳聚糖，因乙酰基被大部分脱除，只有壳聚糖酶才能对其进行较彻底水解以制备获得壳寡糖。而低脱乙酰度壳聚糖，因保留较多N-乙酰氨基葡萄糖组分，除壳聚糖酶外，广泛存在于动植物及微生物中的几丁质酶也可对其较充分水解，从而可以用于制备具有新的结构特征的壳寡糖。多种商品酶，如纤维素酶、蛋白酶及脂肪酶等，因其中具有降解壳聚糖活性酶类，已被报道用于壳寡糖的制备，具有容易获得且可规模化方法等优势[20-24]。然而，这些粗酶中降解壳聚糖的活性酶类的具体蛋白组分仍不清晰，而且一些微生物发酵来源的商品酶中可能同时带有多种壳聚糖酶及几丁质酶，其降解产物的结构较为复杂，给后续组分分离及构效关系研究带来困难。而利用表达的专一性壳聚糖水解酶类水解低脱乙酰度壳寡糖则可以获得结构可控的壳寡糖。

在壳寡糖规模制备过程中，所用水解酶的耐高温性能十分重要。在前期研究中，Oku等[25]发现来源于强烈炽热球菌的几丁质酶同时具有两个水解活性结构域，且结构域2单独使用时具有最高的几丁质酶水解活性。该研究使用的底物为甲壳素，并没有对该酶水解低脱乙酰度壳聚糖的能力及其产物结构特性进行鉴定。因此，本研究进一步确定其降解低脱乙酰壳聚糖的能力并对其水解产物的结构进行鉴定，可以为低脱乙酰度壳寡糖的规模制备及其结构与功能关系研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

表达载体pET28a为本实验室保存；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、感受态细胞Escherichia coli DH5α及BL21 宝日医（北京）生物技术有限公司；甲壳素（来源于虾壳；货号：900332） 美国Sigma-Aldrich公司；内切酶NdeI及BamHI、蛋白Marker（货号：26617）、乙腈（色谱纯） 美国Thermo Fisher公司；混合多肽标准样品、2,5-二羟基苯甲酸（货号：201346）德国Bruker公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Autoflex III smartbeam型基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）仪 德国Bruker公司；AVANCE III 600MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 瑞士Bruker公司；TSK GEL4000PWXL凝胶色谱柱（7.8 mm×300 mm） 日本Tosoh公司；高效液相色谱仪（配备可变波长紫外检测器及蒸发光检测器和色谱工作站） 华谱科仪（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 强烈炽热球菌几丁质酶基因全合成、克隆及表达

在本研究中，选择强烈炽热球菌几丁质酶的结构域2（NCBI Reference Sequence: WP_011012376.1, 258-717）的编码核酸序列进行全基因合成（委托上海生工生物工程有限公司完成），并在合成前在5’及3’末端分别添加NdeI及BamHI酶切位点以利于后续表达载体构建。使用NdeI及BamHI对合成的含有目的基因片段的质粒pUC57及表达载体pET28a进行双酶切，分别回收目的片段及表达载体，使用T4连接酶进行连接并转化至E. coli DH5α。提取重组载体质粒并使用上述双酶切方法获得正确的重组克隆，转化至E. coli BL21中在16 ℃条件下使用异丙基硫代半乳糖苷诱导24 h。离心回收菌体并对其进行超声破碎，进一步离心获得上清液，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）查看蛋白表达情况。

1.3.2 低脱乙酰壳寡糖制备

低脱乙酰度壳聚糖的制备参考Kurita等[26]的方法。脱乙酰度测定使用1H NMR，具体方法为：称取5 mg制备的壳聚糖，加入0.5 mL超纯水及0.25 μL浓盐酸，充分溶解后冻干，冻干样品加入0.5 mL D2O，待其充分溶解后加样检测。以3-（三甲基甲硅烷基）丙酸-D4钠盐为内标，参考Lavertu等[27]的方法计算其脱乙酰度。称取1 g制备的部分脱乙酰壳聚糖，加入100 mL超纯水及0.35 mL浓盐酸，充分溶解后加入100 μL几丁质酶诱导上清液，85 ℃搅拌反应24 h。反应结束后离心去沉淀，上清液经旋转蒸发浓缩后冻干，用于后续分析。

1.3.3 低脱乙酰度壳寡糖分子排阻高效液相色谱（size exclusion high performance liquid chromatography，SEHPLC）分析

称取10 mg壳寡糖样品，溶解于1 mL超纯水中，配成10 mg/mL壳寡糖溶液。具体分析方法为：使用TSK GEL4000PWXL凝胶色谱柱进行相对分子质量分布分析，以相对分子质量1 000、5 000及25 000的葡聚糖为对照，进样量10 μL，流动相0.1 mol/L的甲酸铵（pH 3.2）；检测器温度50 ℃；柱温35 ℃；流速1 mL/min；进样量20 μL，蒸发光检测器进行检测。

1.3.4 低脱乙酰度壳寡糖MALDI-TOF MS分析

吸取7 μL三氟乙酸于7 mL超纯水中，配制成体积分数0.1%三氟乙酸溶液，再加入3 mL乙腈混匀，记为TA30溶液备用。称取20 mg的基质2,5-二羟基苯甲酸，溶解于1 mL的TA30溶液中，配制成20 mg/mL基质溶液。称取10 mg壳寡糖样品，溶解于5 mL TA30溶液中，配成2 mg/mL壳寡糖溶液。吸取壳寡糖溶液1 μL于样品靶上，待其自然干燥后再点上1 μL基质溶液，充分干燥。检测样品前先使用混合多肽标准样品对相对分子质量进行校准。样品靶放入MALDI-TOF MS后，使用正离子反射模式进行检测。

1.3.5 低脱乙酰度壳寡糖NMR分析

使用1H NMR及13C NMR分别对酶解制备的壳寡糖的还原端及非还原端单糖组成进行分析，具体方法为：称取25 mg制备的壳寡糖冻干样品，加入0.50 mL D2O，待其充分溶解后加样检测。以3-（三甲基甲硅烷基）丙酸-D4钠盐为内标，使用AVANCE III 600 MHz NMR仪对样品进行检测，其中，1H NMR检测时对水峰进行抑制以减少其干扰。获得的原始数据使用核磁分析软件MestReNova打开后，使用内标校正位移值，参考Sasaki等[28]的方法对特定部位单糖进行标记，具体的参考位移值包括1H NMR中的还原端氨基葡萄糖（-D，δ 5.19）、还原端N-乙酰氨基葡萄糖（-A，δ 5.43）、还原端两个连续N-乙酰氨基葡萄糖（-AA，δ 4.70）以及13C NMR中5位碳（C5）的非还原端氨基葡萄糖（D-，δ 79.0）、非还原端N-乙酰氨基葡萄糖（A-，δ 78.5）等。

2 结果与分析

2.1 强烈炽热球菌几丁质酶基因全合成、克隆及原核表达

将全基因合成的几丁质酶基因（记为chiB）克隆至表达载体pET28a中，挑取3 个克隆菌落提取质粒及双酶切电泳结果显示，酶切产物E1及E2获得了预期大小（1 395 bp）的片段，而酶切产物E3中没有出现预期大小片段，说明为假阳性（图1A）。E1原始质粒的双末端测序结果确认目的基因被正确插入表达载体中。将E1原始质粒转化至E. coli BL21中，对诱导表达产物P及其诱导前对照C进行SDS-PAGE分析，结果显示，诱导后在40～55 kDa的位置出现了一个新的蛋白条带，与chiB编码的蛋白（记为CHIB）的理论分子质量50.6 kDa相符（图1B）。

图1 几丁质酶基因chiB重组质粒酶切产物（A）及其蛋白表达产物（B）电泳图谱Fig. 1 Electrophoresis maps of restriction enzyme hydrolysates recombinant plasmid harboring chiB gene (A) and protein expression products (B)

2.2 几丁质酶CHIB水解制备低脱乙酰度壳寡糖及组分鉴定

为证实诱导表达的几丁质酶具有壳聚糖降解活性，以制备的低脱乙酰度壳聚糖（1H NMR鉴定其脱乙酰度为62%）为底物，使用该酶的诱导上清液对其进行充分水解，对水解产物（记为CHIB-62）进行MALDI-TOF MS分析（图2）以确定其主要寡糖组成。结果显示，水解物中存在聚合度2～9、不同脱乙酰度的壳寡糖组分；所有的寡糖组分中均含有N-乙酰氨基葡萄糖，这也与几丁质酶特异性识别该单糖相符。该结果也说明，利用全基因合成方法合成并克隆表达的CHIB确实具有几丁质酶活性。

图2 CHIB-62 MALDI-TOF MS分析Fig. 2 MALDI-TOF MS analysis of CHIB-62

2.3 低脱乙酰度壳寡糖CHIB-62分子质量分布

MALDI-TOF MS方法在反射模式下只能对分子质量较小（如相对分子质量小于2 000）的组分进行测定。为确定CHIB-62中寡糖的真实分子质量分布，使用SE-HPLC对其进行分析。结果显示，CHIB-62在1 000～5 000的相对分子质量范围内均有壳寡糖分布（图3）。以上结果说明，利用CHIB水解低脱乙酰度壳聚糖，除相对分子质量2 000以下的壳寡糖外，还可以获得更高分子质量的产物。壳寡糖生物活性的发挥与其相对分子质量大小直接相关。因此，CHIB-62可能比传统方法制备的高脱乙酰度壳寡糖（相对分子质量一般小于2 000）具有更高或者全新的生物活性。

图3 CHIB-62的SE-HPLC图谱Fig. 3 SE-HPLC analysis of CHIB-62

2.4 低脱乙酰度壳寡糖CHIB-62末端结构鉴定

1H NMR对CHIB-62的末端结构分析结果显示，CHIB-62中的壳寡糖还原端主要为两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖（-AA，图4A）；13C NMR分析结果显示，CHIB-62的非还原端主要为氨基葡萄糖（D-），也包含少量的N-乙酰氨基葡萄糖（A-），具体如图4B所示。13C NMR结果还显示，壳寡糖的中间区域单糖组成中，两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖结构（-AA-）明显少于其他结构，而两个连续的氨基葡萄糖（-DD-）则明显多于其他结构，说明在几丁质酶水解的过程中，前者（-AA-）容易被识别并水解，而后者（-DD-）则因不被水解而富集。该结果也与几丁质酶的水解特性相符。Nakamura等[29]已经对CHIB中的催化区结构进行了解析，结果显示，该酶属于糖苷酶18家族，而该家族几丁质酶水解的特征便是需要结合-1位的N-乙酰氨基葡萄糖，从而使其产物的还原端均由该单糖单元组成，这也与本研究1H NMR分析结果一致。1H NMR结果还进一步显示CHIB的水解产物还原末端主要由-AA结构构成，这与来源于黏质沙雷菌的几丁质外切酶的水解特性相似[30]。而前期结构鉴定结果提示CHIB为内切型几丁质酶，水解实验中，CHIB能够对底物进行快速水解也初步验证了该推测[25]。因此，CHIB作为来源于古菌的几丁质酶，具有自身的水解特征，即可以通过内切方式快速水解低脱乙酰底物，获得的产物末端主要由-AA结构构成。这些部分确定结构的壳寡糖对于其结构与功能关系研究意义重大。

图4 CHIB-62的1H NMR（A）及13C NMR（B）鉴定Fig. 4 1H NMR (A) and 13C NMR (B) identification of CHIB-62

3 结 论

本研究利用全基因合成方法合成并克隆表达了来源于强烈炽热球菌的几丁质酶，并利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖制备了低脱乙酰度壳寡糖CHIB-62。组分分离及结构鉴定结果显示，CHIB-62的分子质量分布范围为1 000～5 000，所有寡糖组分中均带有N-乙酰氨基葡萄糖；不仅如此，寡糖的还原末端主要由两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖构成。与传统壳寡糖相比，CHIB-62含有更多较高聚合度的壳寡糖组分，带有更多的N-乙酰氨基葡萄糖且还原末端组分确定，可能具有新的或者更高的生物活性。后续将对这些组分进行分离并对其生物活性进行更深入研究。